הכתם של רייט: רציונל, חומרים, טכניקה ושימושים - ביולוגיה - 2025

רייט הכתם הוא טכניקה מכתימה נוצרה על ידי הפתולוג אמריקני ג'יימס הומר רייט ב 1902, מבוסס על כתם Romanowsky. מכיוון שכתם רומנובסקי לא היה יציב, רייט שילב מתנול כממס וקיבעתי.

צביעה זו היא פוליכרומטית, כלומר היא מייצרת מספר צבעים בהתאם למבנה הקולט את הצבע. טכניקת מכתים זו הייתה בשימוש נרחב לביצוע ספירת תאי דם לבנים דיפרנציאליים וללימוד המורפולוגיה של כדוריות דם אדומות, טסיות דם ולויקוציטים בדם היקפי ומח העצם.

מריחות דם היקפיות שונות המוכתמות בכתם של רייט. א. לוקמיה חריפה. B. פלסמודיום ויווקס בתוך האריתתרוציט. C. פלסמודיום falciparum, מקרוגמטוציטים. ד. לימפוציט

יישומה חשוב מאוד, מכיוון שניתן לראות חריגות בקווי התאים השונים בדם, מה שמקל על אבחון מחלות כמו לוקמיה או זיהומים חיידקיים או טפיליים.

אולי אלה היישומים הנפוצים ביותר שבהם משתמשים בטכניקה זו, אולם הם אינם היחידים. זה שימושי גם בדגימות שאינן דם ומח העצם, כגון פריקה מהאף, ריר צואה, כיח, דגימות עור, בין היתר.

רציונל לכתם של רייט

הכתם של רייט נולד מהכתם של רומנובסקי, המורכב מתמיסת אלכוהול מתיל של צבע חומצי (eosin Y) וצבע בסיסי (כחול מתילן) ומוצרי החמצון שלהם.

תערובת הצבעים המשמשים בכתם של רייט גורמת לאפקט המכונה רומנובסקי, כלומר הוא מעניק צבע סגול יפהפה לגרעינים של לויקוציטים וגרגרי נויטרופיליים, בעוד שתאי הדם האדומים מכתים ורודים.

המרכיבים האחראיים למתן מכלול הצבעים האופייני לכתם של רייט הם כחול B ואאוזין Y. ההשפעה שנצפתה תהיה תלויה בקשירת הצבעים למבנים כימיים ובאינטראקציה של כחול B ואאוזין Y.

מבנים חומציים כמו חומצות גרעין, חלבונים גרעיניים והציטופלסמה הבלתי תגובית של סוגים מסוימים של תאים מקבעים כחול B (כתם בסיסי).

בעוד שמבנים בסיסיים כמו המוגלובין, גרגרי האאוזינופילים מפולחים, בין מבנים תאיים אחרים, קושרים את האאוזין Y (צבע חומצה).

ניתן להשפיע על תוצאת ההכתמה מגורמים שונים, כמו pH של צבע רייט, החוצץ ופתרון הכביסה; כמו גם זמן הכתמה וקיבוע.

לפיכך, כל שלב בהכנת הריאגנטים הוא קריטי ועליו להתבצע תוך הקפדה על כל פרט ופרט.

חומרים

הכתם של רייט. עבור 100 מ"ל זה נדרש:

שקלו 0.3 גרם מהכתם של רייט, מדדו 97 מ"ל מתנול ו -3 מ"ל גליצרול.

הכנה

בתוך מרגמה מניחים את הכמות הצבועה של הצבע של רייט ומשלבים בהדרגה את הגליצרול עד להמסה מלאה של האבקה.

בהמשך מוסיפים את המתנול, מערבבים ומוזגים לבקבוק ענבר.

לפני השימוש יש לנער את הפתרון בתנועות עדינות ולסנן.

פתרון מאגר מאופץ

בליטר אחד של מים מזוקקים, 3.76 גרם של נתרן נתרן הידרופוספט (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) בתוספת 2.1 גרם של dihydrogen אשלגן פוספט (KH ₂ PO ₄ ).

מערבבים היטב עד להמסת כל ריאגנטים המשולבים. התאם את ה- pH ל- 7.2. יוצקים לצנצנת זכוכית ושומרים בטמפרטורת החדר.

חומרים נוספים הדרושים לביצוע הצביעה

בנוסף, חומרים אחרים נדרשים בכדי להיות מסוגלים לבצע את טכניקת הצביעה, אלה הם: שקופיות או מכסים חפצים, גשר צביעה, חולצות עם מים או חיץ לשטיפה, טיימר לשמירת זמני הצביעה וכמה חומר ייבוש (נייר סופג, גזה או כותנה).

מרכיבי הכתם של רייט

מתנול

אלכוהול (מתנול) משמש כמקבע למריחת הדם למגלשה.

בעיקרון זהו מגיב להפחתת, התייבשות וקיבוע של קרישה. לכן, תפקידה לקריש חלבונים ולהפוך אותם לבלתי מסיסים, אך מבלי להפחית אותם בפועל.

מתנול הוא המגיב הנפוץ ביותר לקיבוע מריחות בכל המעבדות, מכיוון שהוא מספק תוצאות טובות יותר מאשר אתנול. הריכוז האידיאלי הוא 99%.

מַנחֵת

למאגר (תמיסת חוצץ) יש תפקיד של התאמה או שמירה על pH של הצבע, שכן pH שמותאם ל 7.2 הוא חיוני כדי שמבני התא יוכלו לספוג את הצבעים כראוי.

מצד שני, שלב קיבוע המתנול מייבש את התאים והחוצץ מסייע להתייבשותם.

Eosin (Y)

לאוזין יש זיקה לאבני בניין מכיוון שמדובר בצבע חומצה. שני סוגים של אאוזין ידועים מאוד זה לזה, עד כדי כך שניתן להשתמש באחד מהשניים ולקבל את אותה התוצאה.

האחד נקרא eosin Y, eosin צהוב, או tetrabromofluorescein, והשני נקרא eosin B, erythrosin B כחלחל, או dibromodinitrofluorescein. עם זאת, eosin Y הוא הנפוץ ביותר.

המאפיין החשוב ביותר של צבע זה הוא הקוטביות השלילית שלו, וזה גורם לו להימשך למבני תאים טעונים חיובית.

מתילן כחול

זהו הצביעה הבסיסית. המאפיין העיקרי שלה הוא מטאצ'רומה, כלומר לא כל המבנים יוכתמו באותו צבע, זה תלוי בהרכב הכימי של המבנים שאתה צובע.

חלקם יהפכו בהירים או כחולים כהים, וחלקם יהפכו בצבע סגול כהה או לילך חיוור.

טֶכנִיקָה

1 - בצע את התפשטות הדגימה כך שיישאר סרט דק, בין שקופיות או שקופיות.

2-תן לו להתייבש באוויר למשך כשעתיים.

3 - הניחו את מריחת היבשים על גשר המכתים או מגש ההכתמה כשפיזור הדגימה פונה כלפי מעלה.

4 - כיסו את הסדין בכתם רייט טיפה אחר טיפה עד לכיסוי כל המשטח. משאירים למשך 5 - 8 דקות.

5 - הכתם אמור לכסות את השקף לחלוטין, מבלי לשפוך אותו על הקצוות. אם במהלך הצביעה הוא מתחיל להתאדות, יש להוסיף כמה טיפות נוספות.

6-בהמשך להוסיף כמות שווה של בולם הזעזועים, לנשוף מעט עד להופעת הברק המתכתי האופייני. זמן 10 עד 15 דקות.

שוטפים במי ברז, מניחים את הנחל העדין עד שהגיליון נראה ורוד.

8 - עם גזה ספוגה באלכוהול, הסר את הצבע שדבק בחלק האחורי של השקופית.

9-תן למריחה להתייבש היטב לפני שמניחים את שמן הטבילה כדי להציג אותו מתחת למיקרוסקופ.

תוֹעֶלֶת

המטולוגיה

זה אידיאלי לכתמת מריחות דם היקפיות, לבדיקת מריחות דם עבות ולחקר תאים מדגימות מח עצם.

בשל התכונות הכימיות של שילוב צבעים זה, ניתן לזהות בקלות את מבני התא, ולהבחין בין סוגי התאים השונים.

נזלת

טכניקה זו שימושית מאוד לזיהוי תאי הפרשות האף (תאי אפיתל, אאוזינופילים מפולחים, תאים פולימורפונוקלריים) באבחון של נזלת אלרגית.

טפילות

במובן זה, זה שימושי למחקר Leishmania sp בתוך ההיסטיוציטים של הרקמה התאית התת עורית בכיב בעור. באופן דומה, הוא משמש לזיהוי לויקוציטים בדגימות צואה (לויקוגרמה צואתית).

במקרה זה, מעניין הרופא לדעת האם הלוקוציטוזה הקיימת בצואה היא פולימורפונוקליארית או מונונקולית. ממצא זה בלוקוגרמה צואתית ידריך אם מדובר בזיהום חיידקי או ויראלי בהתאמה.

מצד שני, ניתן למצוא טפילים המסתובבים בדם בתוך האריתתרוציט או בחינם בפלסמה. הטפילים המבוקשים הם פלסמודיום spp, Trypanosoma cruzii ו- filarias, וברפואה הווטרינרית זה מועיל בחיפוש אחר Theileria equi ו- Babesia caballi, סוכנים סיבתיים לבביות, במיוחד אצל סוסים.

כתם רייט וגם כתם ג'יימסה מאפשרים להבדיל את ההמופראזיטים מהמרכיבים הסלולריים הרגילים. ניתן להשתמש בשני סוגים של ממרחים לכך:

מורחים דק

הדם מופץ כסרט דק בשקופית. הוא מוכתם בכתם של רייט, וחושף את מאפייני הגרעין והציטופלזמה.

טיפה עבה

מתודולוגיה זו משמשת לבדיקת הימצאותם של טפילים בכמות גדולה יותר של דם.

לשם כך, טיפת דם גדולה מונחת על שקופית. כשהוא שם, הוא צריך להיות מפוזר, ליצור עיגולים גדולים וגדולים יותר מהמרכז כלפי חוץ, באמצעות קצה שקופית אחרת.

לבסוף, בכדי להיות מסוגלים להתבונן בטפילים במריחה העבה, יש להמיר את האריתתרוציטים במים.

דלקות בדרכי הנשימה

ברמת הנשימה טכניקה זו מועילה גם היא, מכיוון שהתאים שנמצאים בדגימות כיח, שטיפת הסימפונות או הסימפונות, חשובים לביסוס האבחנה.

באופן דומה ניתן להבחין כאן בין תאים פולימורפונוקלריים ותאים חד-מוחיים.

בַּקטֶרִיוֹלוֹגִיָה

השימוש בטכניקה זו בבקטריולוגיה מוגבל, מכיוון שהוא לא טוב להכתמת חיידקים, וזו הסיבה שמשמשות טכניקות צבעוניות מיוחדות אחרות לכתמתם.

עם זאת, הוא שימש לחיפוש תאי אפיתל עם גופי הכללת כלמידיה טרכומטיס במריחות רירית בשופכה או אנדו-צוורית, אם כי יש להכיר בכך שהיא אינה השיטה הטובה ביותר לכך.

ניתן גם לראות חיידקים דמויי ספירלה כמו Borrelia burgdorferi בקרב תאי דם אדומים בקרב חולים נגועים, כמו גם גופות מורולאיות או הכללה של Ehrlichia sp בציטופלסמה של לימפוציטים, מונוציטים או נויטרופילים במריחת דם.

מיקולוגיה

כמוסת ההיסטופלזמה היא פטריה פתוגנית המאובחנת לעתים קרובות על ידי התבוננות מיקרוסקופית בדגימות רקמות שונות, מוכתמות בכתם של רייט.

כיצד נצפים מבני דגימת הדם בכתם של הרייט?

מקור: Retamales E, מכון Mazo V. לבריאות הציבור, ממשלת צ'ילה. המלצות להכתמת מריחות דם לקריאת ההמוגרמה.

המלצות להכתמה טובה

מגלשות דגימות דם צריכות להתייבש באופן ספונטני. מריחות צריכות להיות דקות ככל האפשר כדי לקבל קיבוע טוב יותר של הצבע ולהימנע מכתמת יתר.

לכתמים באיכות גבוהה, רצוי להכתים תוך שעתיים מרגע הכנת המריחה. מצד שני, הדגימה האידיאלית היא דם נימי, ללא נוגד קרישה.

עם זאת, אם משתמשים בדם ורידי, יש להשתמש בו כ- EDTA נוגד קרישה ולא כהרין, מכיוון שהאחרון יכול לעוות מבני תאים.

כדי למנוע הידרדרות של הצבע המוכן, יש לאחסן אותו במקומות יבשים.

בתהליך הכביסה מומלץ להשתמש במים המותאמים לרמת pH ניטראלית.

לבסוף, רצוי לבדוק מדי פעם את שיטות ההכתמה הנהוגות במעבדה.

הדבר נעשה על ידי מכתים של דגימות או דפוסים מורחבים, כבקרת איכות. שלב זה חשוב מכיוון שהוא מבטיח כי ההכתמה מוכנה כראוי וזמני ההכתמה הם סטנדרטיים היטב.

אם גיליון התבנית בצבע גרוע, ישנן בעיות שיש לפתור.

טעויות נפוצות בכתמי רייט

מכתים חיוורים מאוד

מריחות חיוורות מאוד נובעות בדרך כלל בגלל זמן מכתים קצר מאוד או שטיפה מוגזמת. זה מתוקן על ידי הארכת זמן המגע עם הצבע או קיצור זמן הכביסה.

הצבע משקע

נוכחותם של משקעים של צבע במריחה יכולה להיות מספר גורמים, עם זאת, הסיבות השכיחות ביותר הן: שימוש בצבע לא מסונן, מכתים על גשרי מכתים לא אחידים, שימוש בסדינים מלוכלכים באבק או שומן, לא שטיפה טובה מכתים שלמים.

מריחה אדומה או כחולה במיוחד

החוצץ אחראי על pH של הצבע. צבעים עם pH מתחת למצביע (חומצי) יגרמו למריחות אדמדמות מאוד.

אם pH של הצבע הוא מעל (אלקליין) יתקבל מריחה כחלחל במיוחד.

מצב אחסון

יש לאחסן את המגיב בטמפרטורת החדר.

הפניות

1. Gutiérrez V. מחקר השוואתי בין שיטת ההכתמה של רייט ובדיקת אליסה לאבחון של כלבי ארליכיוזיס בעיר סן פדרו סולה, הונדורס. 2008. עבודת תואר כדי להיות זכאי לתואר רפואי וטרינרי. אוניברסיטת סן קרלוס מגואטמלה.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. כתמים בסיסיים במעבדה למיקרוביולוגיה. מחקר בנושא מוגבלות. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "הכתם של רייט." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 18 מאי 2018, 12:05 UTC. 8 דצמבר 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. תדירות Babesia spp. בציד סוסים בקורדובה (קולומביה). הכמורה לידיעת הודיעה. 2013; 16 (2): 451-458.
5. פורבס B, Sahm D, Weissfeld A (2009). אבחון מיקרוביולוגי של ביילי וסקוט. 12 ed. ארגנטינה. Panamericana SA העריכה
6. Retamales E, Mazo V. המכון לממשל לבריאות הציבור בצ'ילה. המלצות להכתמת מריחות דם לקריאת ההמוגרמה.