כתם גרם: רציונל, חומרים, טכניקה ושימושים - ביולוגיה - 2025

כתם גראם הוא פשוט ביותר ושימושית מכתים טכניקה במיקרוביולוגיה אבחון. טכניקה זו נוצרה על ידי הרופא הדני האנס כריסטיאן גראם בשנת 1884, שהצליח לסווג חיידקים כגרם חיובי וגרם שלילי, בהתאם להרכב דופן התא.

הטכניקה עברה שינויים מסוימים על ידי האקר בשנת 1921 כדי לייצב את החומרים המגיבים ולשפר את איכות ההכתמה, וזו הסיבה שכתם הגראם ידוע גם בשם גראם-האקר.

מריחות שונות המוכתמות בכתם גראם. א. קוקי חיובי. ב. מוטות שליליים. ג. Bacilli חיובי-גרמי, פולימורפונוקליארי ומונו-גרעיני. ד. שמרים.

בעזרת טכניקה זו ניתן גם להתבונן בצורת המיקרואורגניזמים, כלומר אם מדובר בקוקצ'י, בסילי, קוקוקובצילי, pleomorphic, נימה, בין היתר. וכן התפלגותו בחלל: באשכול, בשרשרת, מבודד, בזוגות, בטראטות וכו '.

כאשר יש חשד לזיהום בקטריאלי, יש למרוח את מרבית הדגימות שהתקבלו בשקופית ולגרום להכתמת גרם לבדיקה מיקרוסקופית.

דו"ח גראם ידריך את הרופא באיזה סוג של מיקרואורגניזם עשוי להיות הגורם לזיהום, לפני שתשיג את התוצאה התרבית הסופית.

בחלק מהמקרים חייו של המטופל נפגעים מאוד, ולכן רופאים זקוקים בדחיפות לדו"ח הגראם כדי להעניק טיפול אמפירי, בזמן שהם ממתינים לזיהוי המיקרואורגניזם.

לדוגמה, אם ה- Gram מגלה שיש נוזלים מוחיים חיוביים בגראם, הרופא ידריך את הטיפול הראשוני באנטיביוטיקה המבטלת סוג זה של חיידקים, על פי הפרוטוקולים שנקבעו לכך.

לאחר שתגיע התוצאה הסופית עם שם המיקרו-אורגניזם המבודד והאנטיביוגמה המתאימה לו, הרופא יעריך אם לשנות את הטיפול או לא. החלטה זו תתקבל על פי מחקר הרגישות של המיקרואורגניזם לאנטיביוטיקה שהוא מקבל והתפתחות המטופל.

בָּסִיס

זוהי טכניקה הכוללת 4 שלבים בסיסיים: מכתים, קיבוע עם הנטרול, שינוי צבע וספירה. לכן טכניקה זו, בנוסף לצביעת החיידקים, מאפשרת גם להבדיל ביניהם.

סגול קריסטל הוא הצבע הראשון בו משתמשים. יש לו זיקה לפפטידוגליקאן והוא יכתים את כל החיידקים המצויים בסגול, לאחר מכן מונח הלוגול, המשמש כמורדנט, כלומר הוא יגרום להיווצרותם של קומפלקסים ויודיים-ויודיים בלתי-מסיסים - חלבונים ריבונוקלריים בתוך התא. .

חיידקים גראם חיוביים, בעלי קיר עבה של פפטידוגליקן, יוצרים קומפלקסים נוספים (יוד סגול-קריסטל), ולכן הם שומרים על הצבע.

בנוסף, הוא משפיע גם על כך שקיר חיידקי Gram חיובי מכיל כמות גדולה יותר של חומצות בלתי רוויות, המראים זיקה רבה לחומרים מחמצנים (Lugol).

בינתיים, לחיידקים גראם שליליים יש שכבה דקה של פפטידוגליקן, מה שגורם לחיידקים להיווצר פחות קומפלקסים מאלו שחיובי גראם.

ואז מגיע שלב הצבע, בו חיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים מתנהגים אחרת.

חיידקים גראמיים שליליים מכילים קרום חיצוני העשיר בליפופוליסכרידים שהוא חלק מדופן התא שלהם. שומנים נהרסים על ידי מגע עם אלכוהול אצטון, כך שהקרום החיצוני הופך להיות יציב, ומשחרר את הגביש הסגול.

כך מנגנים אותו אז עם ספראנין או פוקסין בסיסי, כשהוא הופך לאדום.

במקרה של חיידקים גראם חיוביים, הם מתנגדים לדעוך מכיוון שהאקונומיקה עובדת על ידי סגירת הנקבוביות, ומונעת מתהליך הדלפה של תסביך סגול / יוד קריסטל.

לכן הצבע עם סגול קריסטל נשאר יציב, ואין מקום לספרנין או פוקסין. זו הסיבה שחיידקים אלה מכתים כחול או סגול עמוק.

חומרים

סט הכתמים של גראם מורכב מ:

• זכוכית סגולה
• לוגול
• אלכוהול אצטון
• ספרנין או פוקסין בסיסי

הכנת צבעים ומגיבים

תמיסת סגול קריסטל

פתרון ל:

קריסטל סגול ------------- 2 גר '

אתיל אלכוהול 95% ----------- 20cc

פתרון ב ':

אמוניום אוקסלט ----------- 0.8 גר '

מים מזוקקים ------------- 80 סמ"ק

להכנה הסופית של סגול קריסטל, יש לדלל את הפיתרון A 1:10 במים מזוקקים ולערבב אותם עם 4 חלקים של תמיסה B. התערובת מאוחסנת 24 שעות לפני השימוש. לסנן לבקבוק מכתים ענבר בעזרת נייר פילטר.

הסכום שיש להשתמש בו מדי יום מועבר לבקבוק טפטוף ענבר.

יודו-לוגול

שקלו ומדדו את הכמות המצוינת של כל תרכובת כדלקמן:

גבישי יוד ------------- 1gr

אשלגן יודיד ------------- 2gr

מים מזוקקים ------------- 300 סמ"ק

אשלגן יוד מתמוסס לאט לאט במים ואז מוסיפים היוד. הפתרון מגולח לבקבוק ענבר.

הסכום שיש להשתמש בו מדי יום מועבר לבקבוק ענבר קטן יותר עם טפטפת.

הַלבָּנָה

95% אלכוהול אתיל ----------- 50 מ"ל

אצטון ------------------ 50 מ"ל

הוא מוכן בחלקים שווים. מכסים היטב, מכיוון שהוא נוטה להתאדות.

מניחים בבקבוק טפטפת.

תכשיר זה מספק שינוי צבע בזמן בינוני 5-10 שניות והוא המומלץ ביותר.

מתחילים מעדיפים להשתמש רק באלכוהול אתילי 95%, כאשר הדהייה איטית יותר מ- 10 עד 30 שניות.

ואילו המנוסים יותר יכולים להשתמש באצטון טהור, כאשר הצבע מתרחש במהירות רבה בין 1 ל 5 שניות.

בניגוד

פתרון מלאי של ספרן

ספרנינה -------------– 2.5 גר '

אתיל אלכוהול 95% --------– 100 סמ"ק

לאחר שקלול הכמות המצוינת של ספרנין, הוא מומס ב 100 מ"ל של 95% אלכוהול אתילי.

תמיסת הספרנין העובדת מוכנה מפיתרון המלאי.

לשם כך, מדדו 10 סמ"ק מתמיסת הציר, הוסיפו 90 סמ"ק מים מזוקקים להכנת 100 מ"ל.

מומלץ להעביר את הכמות המשמשת מדי יום לבקבוק ענבר עם טפטפת.

מיקרו-אורגניזמים שמכתים גרם שלילי חלש עם כתם Gram-Hucker, כמו אנאירובים מסוימים, Legionella sp, Campylobacter sp ו- Brucella sp, יכולים להיות מוכתמים הרבה יותר טוב באמצעות השינוי של קופלוף של הכתם Gram-Hucker, קרא כתם גראם-קופלוף.

טכניקה זו משנה את צבע הספרנין לפוקסין בסיסי. עם שינוי זה ניתן לצבוע ביעילות את המיקרואורגניזמים שהוזכרו לעיל.

אחסון מגיב

יש לאחסן צבעונים מוכנים בטמפרטורת החדר.

הכנת מריחת הדגימה שתצבע

מדגם חייב להכיל לפחות 10 ⁵ מיקרואורגניזמים לפני התצפית של מיקרואורגניזם בתוך למרוח סביר. ניתן לבצע את המריחות מהדגימה הישירה או מתרבויות בתקשורת מוצקה או נוזלית.

המריחות צריכות להיות אחידות, מבוזרות היטב ולא עבות מדי, כדי להמחשה טובה יותר של המבנים הקיימים.

-גרם של דגימות ישירות

גרם של שתן לא צנטריפוגלי

השתן מעורבב ומניחים 10 μl על שקופית. התבוננות בשדה חיידק / טבילה אחד לפחות מעידה על כך שיש זיהום.

המשמעות היא שלתרבות יהיו בערך יותר מ 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) שתן ב 85% מהמקרים.

שיטה זו אינה מועילה לספירת מושבות מתחת ל 100,000 CFU.

גרם CSF

יש לרכז את ה- CSF, להסיר את הסופר-נפט ולהפיץ את הגלולה בשקופית. נוזל זה סטרילי בתנאים רגילים; התבוננות בחיידקים מצביעה על זיהום.

גרם של דגימות נשימה

גרם השפכים, הסימפונות או הסימפונות גרם, אף על פי שישנם מגוון של מיקרואורגניזמים, תמיד ינחה את האבחנה, בנוסף לשימוש בסוג התאים שנצפה.

במקרה של כיח, יש להכין את המריחה עם החלקים המוכרים ביותר של הדגימה.

גרם של שרפרף

לא מומלץ לבצע גרם על דגימות מסוג זה, מכיוון שאין לו ערך אבחוני.

גרגר יבולים

ניתן לעשות זאת בשתי דרכים, האחת מתרבויות נוזליות והשנייה מתרבויות מוצקות.

תרבויות נוזליות

מתרבויות נוזליות זה פשוט ביותר; מספר צלייה של המרק המעונן נלקחת מתחת למבער ומונחת על מגלשה נקייה ויבשה, תוך ביצוע תנועות מעגליות מהמרכז לכיוון הפריפריה, כדי להפיץ את החומר באופן שווה.

תן לזה להתייבש באופן ספונטני באוויר. לאחר ייבוש החומר מקובע לסדין בחום. לשם כך, בעזרת פינצטה, מועבר הסדין 3 עד 4 פעמים דרך הלהבה של צורב הבונסן, ומקפיד לא לשרוף את החומר.

מותר לסדין להתקרר ומונח על גשר הצביעה.

יבולים מוצקים

כדי לבצע מריחה לכתם גרם מתרבות מוצקה, המשך באופן הבא:

לפני שבוחרים את המושבות שצריך לקחת, יש להכין את השקף ולהניח כשתי טיפות של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית.

אם לוחית התרבות המקורית מכילה מספר סוגים שונים של מושבות, תיבחר מושבה מבודדת מכל אחת שתבצע את הגראם. כל מושבה תילקח עם לולאת הפלטינה להתמוסס בתמיסת המלח שהונחה בעבר על השקופית.

תנועות מעגליות נעשות מהמרכז לכיוון הפריפריה, להפצה הומוגנית של המושבה במגלשה.

תן לזה להתייבש באופן ספונטני באוויר. לאחר היבשה, הסדין מקובע בחום, כפי שהוסבר קודם (על ידי להבהבת המגלשה עם המצית), תוך הקפדה שלא לשרוף את החומר.

יש לבצע הליך זה בכל סוג מושבה שונה. על דף נייר יש לציין את סדר הדברים שנצפה, למשל:

מושבה 1: מושבה צהובה ביתא-המוליטית: קוקוסים גראם חיוביים נצפו באשכולות

מושבה 2: מושבה בצבע קרם, ללא המוליזה: נצפו קוקוקובצילים שלילי גרם.

יש לתייג כל שקופית כדי לדעת מה אנו צופים.

טֶכנִיקָה

טכניקת הכתמת גראם קלה מאוד לביצוע וזולה יחסית ולא ניתן לפספס אותה במעבדה למיקרוביולוגיה.

זה נעשה כדלקמן:

1. תקן את המריחה בחום והניח על גשר ההכתמה.
2. מכסים את השקופית לחלוטין בסגול קריסטל למשך דקה.
3. לשטוף עם מים אל תתייבש
4. מכסים את הגיליון בתמיסה של לוגול, משאירים לפעולה למשך דקה. לשטוף עם מים אל תתייבש.
5. להלבין למשך 5-10 שניות בטלטול עדין באצטון אלכוהול. לחלופין, הניחו את הגיליון במצב אנכי ושמטו טיפות של הסיסמא על פני השטח עד להסרת עודפי הזכוכית הסגולה הלא שמורה. אל תחרוג.
6. לשטוף עם מים אל תתייבש.
7. החלף את השקופית בגשר ההכתמה וכסה למשך 30 שניות בספרנין (Gram-Hucker) או דקה אחת עם פוקסין בסיסי (Gram-Kopeloff).
8. לשטוף במים
9. תן לו להתייבש באוויר באופן ספונטני במצב זקוף.

לאחר היבשה, הניחו טיפה אחת של שמן טבילה בכדי לצפות בו תחת מטרת 100X במיקרוסקופ האור.

תוֹעֶלֶת

טכניקה זו מאפשרת להבחין בהבדלים בין-מורכיים של מרבית החיידקים.

שמרים נבדלים גם בצבע זה. הם לוקחים את סגול הקריסטל, כלומר הם מכים את גראם חיובי.

מצד שני, ניתן להבחין בבזילי גרם-חיוביים הנוצרים נבגים, בהם נצפה מרחב צלול בתוך הבאסילוס, שם נוצר האנדוספור, אם כי הנבגים אינם מכתים היטב. טכניקות אחרות כמו שפר-פולטון משמשות להכתמת נבגים.

יש לציין כי מכתים זו אינה משמשת לצביעת כל סוגי החיידקים, כלומר ישנם מקרים בהם ההכתמה אינה עובדת.

במקרה זה ניתן להזכיר חיידקים חסרי דופן תא. לדוגמא: מין Mycoplasma, spheroplasts, ureaplasma, L-forms and protoplasts.

כמו כן, הוא מכתים חיידקים קשים מאוד עם קירות עשירים בחומצות מיקוליות, כמו Mycobacteria, וחיידקים תוך תאיים כמו כלמידיאס וריקטציאס.

זה גם לא יעיל בהכתמת רוב חיידקי הספירוכטל.

ישנם חיידקים מאותו הסוג שניתן לצפות בדגימה זהה לגראם חיובי ולגרם שלילי. כאשר זה קורה זה נקרא כתם גרם משתנה, שיכול להיות כתוצאה משינוי בחומרים מזינים, טמפרטורה, pH או ריכוז אלקטרוליטים.

טעויות נפוצות

הלבנה מוגזמת

הגזמה בשלב הצבעים עלולה להוביל להתבוננות במיקרואורגניזמים שליליים גראם.

לא מחכה מספיק זמן ייבוש כדי להוסיף את שמן הטבילה

זה יכול לגרום לחיידקים גראם חיוביים להכתים גראם שלילי (גרם שגוי שלילי). זה קורה מכיוון שבתרבויות ישנות יש ככל הנראה חיידקים מתים או מפונקים ובתנאים אלה החיידקים אינם שומרים על סגול הגביש.

השתמש בפתרון לוגול ישן מאוד:

עם הזמן הלוגול מאבד את תכונותיו וצבעו דוהה. אם משתמשים בריגנט המנוון שכבר, הוא לא יתקן היטב את הסגול הקריסטלי, ולכן קיימת אפשרות להשיג הדמיה של מיקרואורגניזמים שליליים גראמיים.

רקע כחול

רקע צבעוני כראוי יהיה אדום. רקע כחול מצביע על כך שהשיפור לא היה מספיק.

הפניות

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. מיקרוביולוגיה רפואית, מהדורה 6 של מקגרו היל, ניו יורק, ארה"ב
2. Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. (מהדורה חמישית). ארגנטינה, עריכה Panamericana SA
3. פורבס B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. ביילי וסקוט אבחון מיקרוביולוגי. 12 ed. ארגנטינה. Panamericana SA העריכה
4. Casas-Rincón G. 1994. Mycology General. המהדורה השנייה באוניברסיטה המרכזית של ונצואלה, מהדורות ספריות. קראקס של ונצואלה.
5. "צביעת גראם." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 4 אוקטובר 2018, 23:40 UTC. 9 בדצמבר 2018, 17:11. נלקח מ- es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual of Microbiology Medical. המהדורה השנייה, ונצואלה: מנהלת התקשורת והפרסומים של אוניברסיטת קרבובו.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. כתמים בסיסיים במעבדה למיקרוביולוגיה. מחקר בנושא מוגבלות. 2014; 3 (1): 10-18.