מכתים נבגים: רציונל, טכניקות ושימושים - ביולוגיה - 2025

מכתים נבג הוא המתודולוגיה ששימשה לצבוע את המבנים התנגדות המהווים חלק סוגים של חיידקים כאשר בתנאים נוחים; מבנים אלה תואמים סוג של הישרדות.

יש הרבה סוגים היוצרים נבגים; עם זאת, העיקריים שבהם הם Bacillus ו- Clostridium. ז'אנרים אלה נחשבים רלוונטיים יותר מכיוון שיש להם מינים פתוגניים לבני אדם.

מכתים נבגים בשיטת שפר - פולטון או וירץ-קונקלין. וטאמבה (מעלה מקורי), מתוך ויקימדיה

כל bacillus יכול להוליד נבג. בזמן הכתמת התכשיר ניתן למצוא את הנבג בתוך הביצילוס (אנדוספור) או מחוצה לו (אקסוספור). בעזרת טכניקות מכתים קונבנציונאליות לחיידקים - כמו כתם גראם - הנבגים נותרים חסרי צבע.

נכון לעכשיו, קיימות מספר מתודולוגיות מכתים המסוגלות לחדור למבנה העבה של הנבג כדי לצבוע אותו. מתודולוגיות אלה מגוונות מאוד; אלה כוללים את טכניקת דורנר, כתם מולר ומתודולוגיית שפר - פולטון, הידועה גם בשם וירץ-קונקלין.

מבין כל הטכניקות שהוזכרו, מתודולוגיית שפר-פולטון היא הנפוצה ביותר במעבדות שגרתיות. הוא נקרא על שם שני מיקרוביולוגים שיצרו את הצבעון בשנת 1930: אלישה שפר ומקדונלד פולטון. עם זאת, לעיתים נקראת הטכניקה וירץ-קונקלין על שם שני בקטריולוגים משנות ה- 1900.

בָּסִיס

הנבגים אינם מכתים כתמים קונבנציונליים מכיוון שיש להם קיר עבה מאוד. ההרכב המורכב של הנבגים מונע כניסת רוב הצבעים.

אם הנבג נחקר מבחוץ פנימה, נצפות השכבות הבאות: ראשית, יש את האקסוספוריום, שהוא השכבה הדקה והחיצונית ביותר שנוצרה על ידי גליקופרוטאינים.

לאחר מכן מגיע לציפורן המספקת עמידות לטמפרטורות גבוהות, ואחריה קליפת המוח המורכבת מפפטידוגליקן. בהמשך נמצא קיר הבסיס המגן על הפרוטופלסט.

הנבג הוא מבנה מיובש המכיל 15% סידן וחומצה די-פיקולינית. לכן, רוב טכניקות הכתמת הנבגים מסתמכות על יישום של חום כך שהצבע יוכל לחדור למבנה הסמיך.

ברגע שהנבג מוכתם, הוא לא יכול להסיר את הצבע. בטכניקת שפר - פולטון, ירוק מלאציט נכנס לתאים צמחיים וכאשר מוחל חום הוא חודר לאנדוספור כמו גם לאקסוספוריות.

על ידי שטיפה במים, הצבע מוסר מהתא הצמחתי. מצב זה מתרחש מכיוון שהצבע הירוק במלכיט הוא בסיסי מעט, ולכן הוא נקשר חלש לתא הצמחתי.

במקום זאת, הוא לא יכול לצאת מהנבג ובסופו של דבר הבסילוס מונה בספרנין. תשתית זו תקפה לשאר הטכניקות, בהן קורה משהו דומה.

טכניקות צביעה של נבגים

כדי לבצע את מכתים הנבג, יש להשיג תרבות טהורה של הזן החשוד הנלמד.

התרבות נתונה בטמפרטורות קיצוניות למשך 24 שעות כדי לעורר את המיקרואורגניזם לסחרור. לצורך כך ניתן להכניס את התרבות לתנור בחום של 44 מעלות צלזיוס או במקרר (8 מעלות צלזיוס) למשך 24 או 48 שעות.

אם נותר זמן רב מדי בטמפרטורות שהוזכרו, רק נצפות אקסוספוריות, מכיוון שכל אנדוספוריות כבר יצאו מהבסילוס.

בסוף הזמן יש להניח כמה טיפות של תמיסה פיזיולוגית סטרילית על שקופית נקייה. ואז נלקח חלק קטן מהתרבות ועושה ממרח עדין.

לאחר מכן נותר לייבוש, קבוע בחום וצבוע בעזרת אחת מהטכניקות שהוסבר להלן:

טכניקת דורנר

1 - הכינו בצינור המבחן השעיה מרוכזת של המיקרואורגניזם הספורטיבי במים מזוקקים והוסיפו נפח שווה של פוקסין של קינון מסונן.

2- הכניסו את הצינור לאמבט עם מים רותחים למשך 5 עד 10 דקות.

3- בשקופית נקייה מערבבים טיפה מההשעיה הקודמת עם טיפה של תמיסת ניגרוזין מימית 10%, מבושלים ומסוננים.

4 - מורחים ומייבשים במהירות בחום עדין.

5- בחן במטרה 100X (טבילה).

הנבגים מכתים אדום ותאי החיידק נראים כמעט חסרי צבע על רקע אפור כהה.

טכניקת דורנר שונה

1- השעיה של המיקרואורגניזם הספורטיבי מתפשטת על מגלשה ומקובעת בחום.

2- המדגם מכוסה ברצועת נייר פילטר שאליה מתווספת פוקסין קרבול. הצבע מחומם במשך 5 עד 7 דקות עם להבתו של צורב הבונסן עד שנוצרת התפתחות אדים. ואז מסירים את הנייר.

3- התכשיר נשטף במים ואז מייבש בנייר סופג.

4 - מכסים את המריחה בסרט דק של 10% ניגרוזין, בעזרת מגלשה שנייה כדי להפיץ את הניגרוזין או מחט.

הצבע שצולמו על ידי הנבגים והחיידקים זהה לזו שתוארה בעבר.

שפר - טכניקת פולטון או וירץ-קונקלין

1 - יש לבצע מריחה עדינה עם השעיה של המיקרואורגניזם הספורטיבי בשקופית והתקן לחום.

2- מכסים את השקופית בתמיסה מימית ירוקה של 5% מלאקיט (ניתן להניח נייר פילטר בשקופית).

3 - מחממים מעל להבה של מבער בונסן בכדי לגרום לשחרור אדים ולהסרת הלהבה. חזור על הפעולה למשך 6 עד 10 דקות. אם התמיסה הירוקה של המלכיט מתאדה יותר מדי במהלך ההליך, ניתן להוסיף עוד.

4 - הסר את נייר המסנן (אם מותקן) ושטוף במים.

5 - מכסים את השקופית ב- 0.5% ספראנין מימי למשך 30 שניות (כמה גרסאות טכניקה משתמשות ב -0.1% ספראנין מימי ומשאירים אותה למשך 3 דקות).

בעזרת טכניקה זו, הנבגים נראים ירוקים והבסיליים אדומים.

יש לו את החיסרון כי תאי האנדוספור של תרבויות צעירות אינם מכתימים היטב, מכיוון שהם נראים ברורים מאוד או חסרי צבע. כדי להימנע מכך, מומלץ להשתמש בתרבויות של 48 שעות של דגירה.

טכניקת מולר

1- מכסים את המריחה בכלורופורם למשך 2 דקות.

2- השלך את הכלורופורם.

3 - מכסים בחומצה כרומית 5% למשך 5 דקות.

4 - שוטפים במים מזוקקים

5 - הסדין מכוסה בקרבול פוקסין-פניקדה ונחשף ללהבה של מבער בונסן עד פליטת אדים; ואז הוא מוסר מהלהבה לכמה רגעים. הפעולה חוזרת על עצמה עד לסיום 10 דקות.

6- שוטפים במים.

7- השתמש באתנול מחומצן (אלכוהול הידרוכלורי) כדי להבהיר. הוא נותר למשך 20 או 30 שניות.

8- שוטפים במים מזוקקים.

9- ניגודיות על ידי כיסוי הגיליון בכחול מתילן למשך 5 דקות.

10- שוטפים במים מזוקקים.

11 - תן לו להתייבש והדגימה נלקחת למיקרוסקופ.

הנבגים נראים אדומים והבסיליים כחולים. חשוב לא לנשום את האדים, מכיוון שהם רעילים ובטווח הארוך יכולים להיות מסרטנים.

טכניקת Möeller שונה ללא חום

בשנת 2007 חיימה ושיתופי הפעולה שלו יצרו שינוי בטכניקת המולר. הם ביטלו את שלב חימום הצבע והחליפו אותו על ידי הוספת 2 טיפות של חומר הפעיל Tergitol 7 לכל 10 מ"ל של תמיסת פוקסין-קרבול קרבול. אותן תוצאות התקבלו.

יישומים

צביעה של נבגים מספקת מידע רב ערך ושימושי מאוד לזיהוי הפתוגן, מכיוון שנוכחותו, צורתו, מיקומו בתוך הביצילוס והיכולת לעוות את התא הצמחתי או לא, הם נתונים שיכולים להנחות את המין מעורב בז'אנר מסוים.

בהקשר זה, כדאי לומר כי הנבגים יכולים להיות עגולים או סגלגלים, הם יכולים להיות ממוקמים במרכז או גם במיקום מרכזי, תת-מיני או מסוף.

תרשים של צורתם ומיקומם של אנדוספורס ואקסוספוריות

דוגמאות

- Clostridium difficile יוצר נבג סגלגל במצב סופני המעוות את הביצילוס.

- נבג הקלוסטרידיום טרציום הוא סגלגל, אינו מעוות את הביצילוס ונמצא ברמת המסוף.

- האנדוספורט של קלוסטרידיום טטאני הוא סופני ומעוות את הביצילוס, ומעניק מראה של תוף.

- נבגי Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy ו- C. septicum הם תת קרקעיים עגולים או סגלגלים ומעוותים את הביצילוס.

- האנדוספורט של קלוסטרידיום סורדלי ממוקם במיקום המרכזי, עם עיוות קל.

Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. (מהדורה חמישית). ארגנטינה, עריכה Panamericana SA

הפניות

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. הצעה לטכניקה מפוענחת להכתמת נבגי החיידקים מבלי ליישם חום - שינוי מוצלח של שיטת מולר. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. תורמים בוויקיפדיה. כתם מולר. ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 3 בנובמבר 2018, 03:28 UTC. ניתן להשיג ב: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). מדריך למעבדות טכניקות מיקרוביולוגיות. המחלקה לאקדמיה למדעי הבסיס למיקרוביולוגיה. המכון הפוליטכני הלאומי.
4. "אנדוספור." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 25 פברואר 2018, 10:20 UTC. 10 בינואר 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. סילבה ל, סילבה סי, פרננדס נ ', בואנו סי, טורס ג'יי, ריקו מ', מקיאס ג'יי ומשתפי פעולה. (2006). אנשי עובדים של הקהילה האוטונומית של אקסטראמדורה. סדר יום ספציפי כרך ד '. MAD עריכה. סביליה-ספרד, עמ '211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). טכנאי מעבדה מומחה, שירות הבריאות גליציאנית (SERGAS). נושא ספציפי לסדר יום נושא 2. עריכה MAD. סביליה-ספרד, עמ '79-80.
7. Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. (מהדורה חמישית). ארגנטינה, עריכה Panamericana SA
8. פורבס B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. ביילי וסקוט אבחון מיקרוביולוגי. 12 ed. ארגנטינה. Panamericana SA העריכה