מריחה חיידקית: מאפיינים והכנה - ביולוגיה - 2025

למרוח החיידקים הנו תוסף סרט דק של השעיה של מיקרואורגניזמים חיידקים כי הוא עשויה על צלחת זכוכית שקופה או שקופיות, להסתכלות במיקרוסקופ אור.

ההרחבה בצורה של סרט מתבצעת על מנת להפריד את המיקרואורגניזמים ככל האפשר, שכן אם הם מקובצים התצפית אינה ברורה.

איור 1. איור 1. מריחה חיידקית שנראתה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. מקור: pixbay.com

במחקר תרבויות חיידקים נעשה שימוש בטכניקות הכנת מריחה, קיבוע וכתמים לצורך ניתוח טוב יותר. בשל גודלם הקטן של מיקרואורגניזמים, השימוש במיקרוסקופ אופטי נדרש בהכרח לצורך התבוננותם.

מיקרוסקופים אופטיים הם מכשירים חיוניים לצפייה במריחות. אלה מעסיקים עדשות אופטיות ומאור המאפשר צפייה בדגימות בהגדלה גבוהה.

באופן כללי, לתאים חיים אין מבנים צבעוניים ברובם, כשרואים במיקרוסקופ האור הם דגימות חסרות צבע ושקוף, והם מראים מעט מאוד ניגודיות פנימית ועם סביבתם.

התבוננות במיקרוסקופ האור הבהיר הפשוט, ללא שימוש בטכניקות צביעה עזר, מוגבלת מאוד ומשמשת רק במקרים מסוימים, כמו למשל בתצפית על תנועת מיקרואורגניזמים.

לצורך התבוננות מיטבית במיקרואורגניזמים, יש ליצור איזון בין ניגודיות לרזולוציה. לא ניתן לראות את פרטי התא במיקרוסקופ, אפילו עם רזולוציה גבוהה; השימוש בצבעים נדרש באמצעות טכניקות מכתים, המספקות ניגודיות להתבוננות.

מאפיינים של מריחת חיידקים באיכות טובה

ניגודיות מעולה

בכדי להשיג ניגודיות מצוינת ישנם מיקרוסקופים מתוחכמים הנקראים מיקרוסקופיות של ניגודי פאזה, מיקרוסקופי הפרעות הפרשי ומיקרוסקופי שדה כהה. סוג זה של מיקרוסקופ משמש לתצפית על מבנים חיידקיים כמו נדן וחוטים, בין היתר.

מכתים היא טכניקה פשוטה להגברת הניגודיות המושגת באמצעות מיקרוסקופ בהירפילד. בטכניקה זו ניתן להשתמש בכתמים שונים המשפרים באופן משמעותי את ההתבוננות המיקרוסקופית.

הכתמים מבוצעים ישירות על מריחות או על השלוחות של מתלי המיקרואורגניזם בשקופיות, בעבר מיובשות וקבועות.

תיקון טוב

קיבוע הוא טכניקה המשמשת לשימור מבני תאים; גורם לא-הפעלה של מיקרואורגניזמים והדבקה לזכוכית המגלשה. ישנם טיפולי תיקון שונים: קיבוע חום וקיבוע כימי.

קיבוע חום

זוהי השיטה הנפוצה ביותר לצפייה במריחות חיידקים. הטכניקה מורכבת מהעברת ההשעיה החיידקית של המריחה דרך להבת מצית. טכניקה זו מסוגלת לשמר את המורפולוגיה החיצונית של חיידקים, אך הורסת את המבנים הפנימיים שלהם.

קיבוע כימי

קיבוע כימי משתמש בכימיקלים לשימור, כגון פורמלדהיד או פורמלין, אתנול וחומצה אצטית, בין היתר. היתרון בשימוש בחומרי קיבוע כימיים הוא בכך ששמירה על המבנים התאיים הפנימיים של המיקרואורגניזמים מושגת.

איור 2. מריחת דם. מקור: Bobjgalindo, מ- Wikimedia Commons

מכתים טובים

הנהלים השכיחים ביותר להכתמת מריחה מיובשת בעבר וקבועה הם מכתים חיוביים או פשוטים, מכתים דיפרנציאליים וכתמים שליליים. ישנן טכניקות מיוחדות גם להכתמת מבני תאים מסוימים (כמוסה, נבג, סמלונים).

מכתים חיוביים או מכתים פשוטים

מכתים חיוביים או פשוטים הם טכניקת הכתמות המריחה הנפוצה ביותר. הוא משתמש בצבעים שיש להם יכולת להיקשר למבנים מיקרוביאליים מסוימים, ומאפשרים לצפות בהם תחת מיקרוסקופ.

לצבעים אלה קבוצות כרומופור (חלק צבעוני) במבנה הכימי שלהם, עם קשרים כפולים לסירוגין וקשרים בודדים (צירוף). קשרים אלה יכולים בתורם ליצור קשרים יוניים או קוולנטיים עם כמה מבנים תאיים.

הצבעים המשמשים מכתים חיוביים או פשוטים הם בעיקר נגזרות כימיות של אנילין (מלחים אורגניים צבעוניים).

לעומת זאת, בקרב הצבעים נוכל למצוא כמה עם pH בסיסי ואחרים עם pH חומצי.

צבעי יסוד

בצבעים בסיסיים, לקבוצת הכרומופור יש מטען חשמלי חיובי. לרוב המוחלט של המיקרואורגניזמים הפרוקריוטיים יש pH פנימי ניטראלי, ומשטח התא שלהם טעון לרעה. באמצעות האינטראקציה האלקטרוסטטית הזו הכרומופור נקשר לתא ומכתים אותו.

דוגמאות לצבעים בסיסיים הם כחול מתילן, סגול קריסטל, ירוק מלכיט, פוסין בסיסי, ספרנין, בין היתר.

צבעי חומצה

בצבעי חומצה יש לקבוצת הכרומופור מטען חשמלי שלילי. אלה משמשים להכתמת חלבונים בקבוצות אמינו טעונות חיובית. דוגמאות לצבעים חומציים הם פוסצין חומצי, בנגל ורד, אדום קונגו ואאוזין.

מכתים דיפרנציאליים

טכניקת הכתמה הדיפרנציאלית מורכבת מרישום של שני צבעים בעלי צבע או עוצמה שונים, כדי להבדיל בין מיקרואורגניזמים שונים תחת המיקרוסקופ. כתם גראם וכתם העמידות לחומצה לאלכוהול הם הכתמים ההבדלים הנפוצים ביותר בבקטריולוגיה.

כתם הגראם משמש כמבחן מקדים על מנת לדעת את הצורה, הגודל, קיבוץ התא, כמו גם את סוג דופן התא. באמצעות בדיקת הכתמים גראם, חיידקי דופן התא מסווגים לחיידקים גראם חיוביים ולחיידקים גראם שליליים.

מכתים שליליים

בטכניקה זו משתמשים בצבעים כימיים שאינם חודרים אל פנים התא, אלא הופכים את המדיום בו המיקרואורגניזמים מופיעים כרקע שחור.

בטכניקת הכתמה השלילית, המריחה מיוצרת מטיפה של תליית הודו או מתלה ניגרוזין, אשר לאחר מתן ייבוש בטמפרטורת החדר יוצר סרט אטום למעבר האור. באופן זה, מיקרואורגניזמים מופיעים כצורות בהירות על רקע כהה.

הכנה

מריחה

1.- שטפו היטב את השקופיות, יבשו עם נייר סופג ותייגו אותן. על התווית לציין את תוכן ההכנה, התאריך ושם האדם שעיבד אותו.

2.- הדליק את המצית ועקר את לולאת החיסון באש עד לאדום בהיר.

3.- תנו לידית להתקרר.

4.- קח את צינור תרבית החיידקים, הסר את הכובע והעביר במהירות את פיה של הצינור ליד להבת הצורב (להבה).

5.- הכנס את לולאת החיסון לצינור המכיל את תרבית החיידקים ולקח את הדגימה.

6.- אם התרבות נמצאת במדיום נוזלי, הניחו את הדגימה שנלקחה עם הידית במרכז השקופית ופיזרו אותה בזהירות בעיגול בקוטר של כ -2 ס"מ.

7.- עקרו שוב את לולאת החיסון.

8.- אפשר למריחה להתייבש באוויר.

9.- חזור על שלבים 3 עד 8 שלוש פעמים.

10.- אם התרבות במדיום מוצק, יש להקדיש טיפה של מים מזוקקים קודם לכן על השקופית. זה נעשה כדי לערבב דגימה קטנה מהתרבות שנלקחה עם לולאת החיסון, כפי שמכוונים בשלבים 2 עד 5 (תנאים אספטיים).

11.- מורחים את הדגימה המדוללת עם טיפת המים בשקופית וחוזרים עליה שלוש פעמים.

ב. קיבוע

1.- הוסף שתי טיפות מתנול או אתנול מוחלט למריחות היבשות - מתרבויות במדיום נוזלי.

2.- אפשר ייבוש אוויר הרחק מהמצית.

3.- אם המריחה מגיעה מתרבית במדיום מוצק, הריח היבש קבוע בחום, ומעביר אותו פעמיים עד שלוש במהירות דרך החלק החם ביותר של הלהבה הקלה יותר.

4.- גע בחלקו התחתון של המריחה עם החלק הגבי של היד השמאלית (למען ימין; אחרת, השתמש ביד ימין) וודא שהוא קר.

ג. מכתים פשוטים

1.- הוסף 2 טיפות של הכתם שנבחר למריחה והשאיר לפעול למשך הזמן הנדרש בפרוטוקולים הספציפיים לכל כתם (בדרך כלל בין 1 ל -5 דקות).

2.- כתמים מסוימים מצריכים שימוש בחום להפעלתם, ובמקרה זה יש להקפיד מאוד על חימום המגלשה בלהבה הבהירה יותר (לתפעל אותה בעזרת פינצטה ולהימנע מרתיחה). התחממות יתר של המריחה עלולה להרוס את התאים שיש לצפות בהם.

3.- הסר את עודפי הצבע על ידי שטיפה במים מזוקקים מפיקטה. הסר את מי השטיפה על ידי הקשה בעדינות על השקופית בשוליה, מוטה על שולחן העבודה.

4. מאפשרים ייבוש אוויר.

5.- בהתאם לסוג התצפית, משתמשים בכיסוי כיסוי או לא בשלב זה. כיסוי הכיסוי מגן ושומר על מריחה. אם נערכת תצפית לטבילה בשמן בשלב זה, לא משתמשים בשטיפות מכסה אך לא ניתן לשמר את המריחה.

ד. שימור מוחלט של מריחה

1.- טבלו את המריחה ברציפות בכל אחד מהפתרונות המפורטים להלן, למשך חמש דקות לפחות. מטרת "אמבטיות" אלה היא להתייבש לחלוטין את המריחה. יש לנקז כל מגיב ביסודיות לפני הכנסת המריחה לאמבטיה הבאה.

סדרן של האמבטיות המתייבשות הוא כדלקמן:

1. אתנול 70%
2. אתנול 95%
3. אצטון טהור
4. תערובת אצטון-קסילול 1: 1
5. קסילול

ואז אפשר להתייבש באוויר.

2.- הרכיב את מכסה המגן, רצוי 22 × 22 מ"מ, באמצעות בלסם קנדה או אמצעי הרכבה אחר.

הפניות

1. Briggs, G. (1965). גורמים סיבתיים בתאונות מעבדה מיקרוביולוגיות וזיהומים. מעבדות ביולוגיות של צבא ארה"ב. פורט דטריק.
2. Cappucino, JG ו- Welch, CT (2017). מיקרוביולוגיה: מדריך מעבדה. פירסון.
3. הולט, עורך ג'ג. (1977). מדריך הקצרה של ברגי לבקטריולוגיה נחושה. בולטימור ^ה -8 : ויליאמס ווילקינס ושות '.
4. ג'ונסון, TR וקייס; CL (2018). ניסויי מעבדה במיקרוביולוגיה. פירסון.
5. טיל, פ (2017). מיקרוביולוגיה אבחנתית. 14 ^th St. Louis, ארה"ב: Elsiever, Inc.