אנזימי הגבלה: פונקציות, סוגים ודוגמאות - ביולוגיה

אנזימי הגבלה הם endonucleases מועסק על ידי קדומים מסוימים וחיידקים כדי לעכב או "להגביל" את התפשטות וירוסים בפנים. הם נפוצים במיוחד בחיידקים והם חלק ממערכת ההגנה שלהם נגד DNA זר המכונה מערכת ההגבלה / שינוי.

אנזימים אלה מזרזים את המחשוף של DNA-band כפול במקומות ספציפיים, לשחזור וללא שימוש באנרגיה נוספת. רובם דורשים נוכחות של קופקטורים כמו מגנזיום או קטיונים דו-ערכיים אחרים, אם כי חלקם דורשים גם ATP או S-adenosyl מתיונין.

סכימת תגובת האנזים להגבלה של HindIII (מקור: Helixitta באמצעות ויקימדיה Commons)

אנדונוקליזות הגבלה התגלו בשנת 1978 על ידי דניאל נתנס, ארבר ורנר והמילטון סמית, שקיבלו את פרס נובל לרפואה על תגליתם. שמם נובע בדרך כלל מהאורגניזם בו הם נצפים לראשונה.

אנזימים כאלה נמצאים בשימוש נרחב בפיתוח שיטות שיבוט DNA ואסטרטגיות ביולוגיות מולקולריות אחרות והנדסה גנטית. מאפייני זיהוי הרצפים הספציפיים שלהם והיכולת לחתוך רצפים קרוב לאתרי זיהוי הופכים אותם לכלים רבי עוצמה בניסויים גנטיים.

ניתן להשתמש בשברים שנוצרו על ידי אנזימי הגבלה שפעלו על מולקולת DNA מסוימת כדי ליצור מחדש "מפה" של המולקולה המקורית על ידי שימוש במידע על האתרים שבהם האנזים חתך את ה- DNA.

לאנזימי הגבלה מסוימים עשויים להיות אותו אתר זיהוי ב- DNA, אך הם לא בהכרח חותכים אותו באותה צורה. לפיכך, ישנם אנזימים החותכים את הקצוות הבוטים והאנזימים החותכים את הקצוות המגובשים, שיש להם יישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.

נכון לעכשיו ישנם מאות אנזימי הגבלה זמינים מסחרית המוצעים על ידי בתים מסחריים שונים; אנזימים אלה מתפקדים כמספריים מולקולריים "מותאמים אישית" למטרות שונות.

מאפיינים

אנזימי הגבלה ממלאים את הפונקציה ההפוכה של פולימראזות, מכיוון שהם מניעים או מפרקים את הקשר האסטר בתוך הקשר הפוספודיאסטר בין נוקליאוטידים סמוכים בשרשרת נוקלאוטידים.

בביולוגיה מולקולרית ובהנדסה גנטית משתמשים בהם בכלים רבים לבניית וקטורי ביטוי ושיבוט, כמו גם לזיהוי רצפים ספציפיים. הם מועילים גם לבניית גנומים רקומביננטיים ובעלי פוטנציאל ביוטכנולוגי רב.

ההתקדמות האחרונה בטיפול בגנים עושה שימוש שוטף באנזימי הגבלה להכנסת גנים מסוימים לווקטורים המהווים כלי תחבורה להעברת גנים כאלה לתאים חיים, וכנראה שיש להם את היכולת להכניס לגנום התא לתפקוד שינויים קבועים.

מנגנון פעולה

אנזימי הגבלה יכולים לזרז את המחשוף של ה- DNA הכפול, אם כי חלקם מסוגלים לזהות רצפי DNA בודדים ואפילו RNA. חיתוך מתרחש לאחר זיהוי הרצפים.

מנגנון הפעולה מורכב מהידרוליזה של הקשר הפוספודיאסטר בין קבוצת פוספט לדוקסיריבוזה בשלד של כל גדיל DNA. רבים מהאנזימים מסוגלים לחתוך באותו אתר שהם מכירים, בעוד שאחרים חותכים בין 5 ל -9 זוגות בסיס לפניו או אחריו.

בדרך כלל אנזימים אלו חותכים בסוף 5 'של קבוצת הפוספטים, ומולידים שברי DNA עם קצה פוספורי של 5' וקצה הידרוקסיל מסופי 3 '.

מכיוון שחלבונים אינם באים במגע ישיר עם אתר ההכרה ב- DNA, יש לתרגם אותם ברצף עד להשגת האתר הספציפי, אולי באמצעות מנגנוני "הזזה" על גדיל ה- DNA.

במהלך המחשוף האנזימטי, הקשר הפוספודיאסטר של כל אחד מגדילי ה- DNA ממוקם באחד האתרים הפעילים של אנזימי הגבלה. כאשר האנזים משאיר את אתר הזיהוי והמחשוף הוא עושה זאת באמצעות אסוציאציות חולפות לא ספציפיות.

סוגים

חמישה סוגים של אנזימי הגבלה ידועים כיום. להלן תיאור קצר של כל אחד מהם:

אנזימי הגבלה מסוג I

אנזימים אלו הם חלבונים פנטאמריים גדולים עם שלוש יחידות משנה, אחת להגבלה, אחת למתילציה ואחת לזיהוי רצף ב- DNA. אנדונוקליזות אלה הם חלבונים רב-פונקציונליים המסוגלים לזרז תגובות הגבלה ושינוי, יש להם פעילות ATPase וגם טופואיזומראז DNA.

אנזימים מסוג זה היו האנדונוקליזות הראשונות שהתגלו, הם טוהרו לראשונה בשנות השישים ונחקרו לעומק רב מאז.

אנזימים מסוג I אינם נמצאים בשימוש נרחב ככלי ביו-טכנולוגי, מכיוון שאתר המחשוף יכול להיות במרחק משתנה של עד 1,000 זוגות בסיס מאתר ההכרה, מה שהופך אותם לא אמינים מבחינת ההתרבות של הניסוי.

אנזימי הגבלה מסוג II

הם אנזימים המורכבים מהומודימרים או טטראמרים החותכים DNA באתרים מוגדרים באורך של 4 ל -8 bp. אתרי המחשוף הללו הם בדרך כלל פלינדרומיים, כלומר הם מזהים רצפים הנקראים באותה צורה בשני הכיוונים.

רבים מהאנזימים המגבילים מסוג II בחיידקים חותכים DNA כאשר הם מכירים באופיו הזר, מכיוון שאין לו את השינויים האופייניים להם צריך להיות ה- DNA הפרטי.

אלה הם אנזימי ההגבלה הפשוטים ביותר מכיוון שהם אינם דורשים קופקטור אחר מלבד מגנזיום (Mg +) כדי לזהות ולחתוך רצפי DNA.

הדיוק של אנזימי הגבלה מסוג II בזיהוי וחיתוך רצפים פשוטים ב- DNA בתנוחות מדויקות הופך אותם לאחד הנפוצים והחיוניים ביותר ברוב ענפי הביולוגיה המולקולרית.

בקבוצה של אנזימי הגבלה מסוג II ישנם תת-סוגים מרובים המסווגים לפי תכונות מסוימות הייחודיות לכל אחד מהם. הסיווג של אנזימים אלו נעשה על ידי הוספת אותיות האלף-בית, מ- A עד Z בעקבות שם האנזים.

חלק מתתי המשנה הידועים בעיקר בזכות התועלת שלהם הם:

תת-פרק IIA

הם אדימרים של יחידות משנה שונות. הם מזהים רצפים א-סימטריים ומשמשים כמבשרים אידיאליים לייצור אנזימי חיתוך.

תת-פרק IIB

הם מורכבים מדאמר אחד או יותר ונחתכים DNA משני צידי רצף ההכרה. הם חתכו את שני גדילי ה- DNA מרווח של זוג בסיס לפני אתר ההכרה.

תת-מחלקה IIC

אנזימים מסוג זה הם פוליפפטידים עם פונקציות של חלוקה ושינוי של גדילי DNA. אנזימים אלה חותכים את שני הגדילים בצורה לא סימטרית.

תת-פרק IIE

האנזימים של תת-סוג זה הם הנפוצים ביותר בהנדסה גנטית. יש להם אתר קטליטי ובדרך כלל הם דורשים אפקט אלוסטרי. אנזימים אלה צריכים ליצור אינטראקציה עם שני עותקים של רצף ההכרה שלהם כדי לבצע מחשוף יעיל. בתוך תת-קבוצה זו נמצאים האנזימים EcoRII ו- EcoRI.

אנזימי הגבלה מסוג III

אנדונוקליזות מגבלות מסוג III מורכבות משתי יחידות משנה בלבד, האחת אחראית על זיהוי ושינוי ה- DNA ואילו השנייה אחראית על מחשוף רצף.

אנזימים אלה דורשים שני קופקטורים לתפקודם: ATP ומגנזיום. אנזימי הגבלה מסוג זה מחזיקים בשני אתרי זיהוי א-סימטריים, מתרגמים DNA באופן תלוי ATP וחותכים אותו בין 20-30 נ"ז הסמוכים לאתר הזיהוי.

אנזימי הגבלה מסוג IV

קל לזהות אנזימים מסוג IV כאשר הם חותכים את ה- DNA בסימני מתילציה, הם מורכבים מכמה יחידות משנה שונות שאחראיות על זיהוי רצף ה- DNA וחיתוךן. אנזימים אלו משתמשים ב- GTP ובמגנזיום דו-ערכי כקופקטורים.

אתרי מחשוף ספציפיים כוללים קווצות נוקליאוטידים עם שאריות ציטוזין מתילציות או הידרוקסימתילטיות על גדילי חומצות גרעין או שתיהן.

אנזימי הגבלה מסוג V

סיווג זה מקבץ את האנזימים מסוג CRISPER-Cas, המזהים וחותכים רצפי DNA ספציפיים מאורגניזמים פולשים. אנזימים מסוג Cas משתמשים בגדול של RNA מדריך מסונתז CRISPER כדי לזהות אורגניזמים פולשים ותוקפים אותם.

אנזימים המסווגים כסוג V הם פוליפפטידים המובנים על ידי אנזימים מסוג I, II ו- II. הם יכולים לחתוך קטעים של ה- DNA של כמעט כל אורגניזם ועם מגוון רחב של אורך. הגמישות שלהם וקלות השימוש הופכים אנזימים אלה לאחד הכלים הנפוצים ביותר בהנדסה גנטית כיום, יחד עם אנזימים מסוג II.

דוגמאות

אנזימי הגבלה שימשו לגילוי פולימורפיזמות של DNA, במיוחד במחקרים גנטיים באוכלוסייה ובמחקרים אבולוציוניים המשתמשים ב- DNA מיטוכונדריאלי, על מנת לקבל מידע על שיעורי התחליפים לנוקלאוטידים.

נכון לעכשיו, הווקטורים המשמשים להפיכת חיידקים למטרות שונות מחזיקים באתרי ריבוי שכפול בהם נמצאים אתרי זיהוי לאנזימי הגבלה מרובים.

בין האנזימים הללו הפופולריים ביותר הם EcoRI, II, III, IV ו- V, המתקבלים ומתוארים לראשונה מ- E. coli; HindIII מ- H. influenzae ו- BamHI מ- B. amyloliquefaciens.

הפניות

Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). ביולוגיה של הגבלת DNA. ביקורות מיקרוביולוגיות, 57 (2), 434–450.
Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, and Horvath, P. (2007). CRISPR מספק התנגדות נרכשת נגד וירוסים בפרוקריוטים. מדע, 315 (מרץ), 1709–1713.
גודסל, ד (2002). הפרספקטיבה המולקולרית: הגבלת אנדונוקליזות. תאי גזע יסודות רפואת סרטן, 20, 190-191.
Halford, SE (2001). קפיצות, קפיצות ולולאות על ידי אנזימי הגבלה. עסקאות בחברה ביוכימית, 29, 363-373.
Jeltsch, A. (2003). שמירה על זהות המינים ובקרת מפרט החיידקים: פונקציה חדשה למערכות הגבלה / שינוי? גן, 317, 13-16.
Krebs, J., Goldstein, E., and Kilpatrick, S. (2018). הגנים של לוין ה- XII (12 עורכים). ברלינגטון, מסצ'וסטס: ג'ונס וברטלט למידה.
Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … She, Q. (2015). רתימה של מערכות מסוג I ו- Type III CRISPR-Cas לעריכת גנום. מחקר על חומצות גרעין, 1–12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). אנזימי הגבלה מסוג I וקרוביהם. מחקר על חומצות גרעין, 1–25.
Nathans, D., and Smith, HO (1975). הגבלה אנדונוקליזות בניתוח ושינוי מבנה של מולקולות DNA. Annu. הכמרית ביוכימ. , 273–293.
Nei, M., & Tajima, F. (1981). פולימורפיזם של דנה הניתן לגילוי באמצעות אנדונוקליזות מגבלות. גנטיקה, 145-163.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). מדעי החיים התאיים והמולקולריים אנדונוקליזות מגבילת סוג II: מבנה ומנגנון. CMLS מדעי החיים הסלולריים והמולקולריים, 62, 685-707.
רוברטס, ר '(2005). איך אנזימי ההגבלה הפכו לסוסי העבודה של הביולוגיה המולקולרית. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
רוברטס, RJ, & Murray, K. (1976). הגבלות אנדונוקליזות. ביקורות ביקורתיות בביוכימיה, (נובמבר), 123-164.
סטודארד, BL (2005). מבנה ותפקוד אנדונוקליז ביתי. ביקורות רבעוניות של ביו-פיזיקה, 1–47.
Tock, MR ו- Dryden, DTF (2005). הביולוגיה של ההגבלה וההגבלה. חוות דעת נוכחית במיקרוביולוגיה, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
ווילסון, ג'יי.ג 'ומורי, נ.ב. (1991). מערכות הגבלה ושינוי. Annu. הכמרית ג'נט. , 25, 585-627.
Wu, Z., & Mou, K. (2016). תובנות גנומיות על ארסיות קמפילובקטר ג'ג'וני וגנטיקה של אוכלוסייה. Infec. דיס. תרגם. מד., 2 (3), 109–119.
יואן, ר '(1981). מבנה ומנגנון של אנדונוקליזות להגבלה רב תכליתית. Annu. הכמרית ביוכימ. , 50, 285-315.

אנזימי הגבלה: פונקציות, סוגים ודוגמאות - ביולוגיה - 2025