אנדונוקליזות: פונקציות, סוגים ודוגמאות - ביולוגיה - 2025

Endonucleases הם אנזימים כי לחתוך את קשר פוספודיאסטרי הממוקם בתוך שרשרת של נוקלאוטידים. אתרי הגבלת אנדונוקליז הם מגוונים מאוד. חלק מהאנזימים הללו חותכים DNA (חומצה deoxyribonucleic, החומר הגנטי שלנו) כמעט בכל מקום, כלומר הם לא ספציפיים.

לעומת זאת, קיימת קבוצה נוספת של אנדונוקליזות שהם מאוד ספציפיים באזור או ברצף שיש לסגור. קבוצת אנזימים זו מכונה אנזימי הגבלה, והם שימושיים מאוד בביולוגיה מולקולרית. בקבוצה זו יש לנו את האנזימים הידועים Bam HI, Eco RI ו- Alu I.

אנדונוקליזות חותכות את ה- DNA באופן פנימי.
מקור: pixabay.com

בניגוד לאנדונוקליזות, ישנם סוגים אחרים של חלבונים קטליטים - exonuclease - האחראים על שבירת קשרי הפוספודיאסטר בסוף השרשרת.

הגבלות אנדונוקליזות

אנדונוקליזות הגבלה או אנזימי הגבלה הם חלבונים קטליטיים שאחראים על פילוק קשרי הפוספודיאסטר בתוך שרשרת ה- DNA ברצפים ספציפיים מאוד.

ניתן לרכוש אנזימים אלו ממספר חברות ביוטכנולוגיה והשימוש בהן הוא כמעט חיוני בטכניקות מניפולציה של DNA עדכניות.

אנדונוקליזות להגבלה נקראות באמצעות האותיות הראשונות בשם המדעי הבינומי של האורגניזם ממנו באו, ואחריהן זן (זה לא חובה) ומסתיים בקבוצת אנזימי ההגבלה שאליה הם שייכים. לדוגמה, Bam HI ו- Eco RI הם אנדונוקליזות בשימוש נרחב.

אזור ה- DNA אותו מזהה האנזים נקרא אתר ההגבלה והוא ייחודי לכל אנדונוקליז, אם כי מספר אנזימים עשויים לחפוף באתרי ההגבלה. אתר זה מורכב בדרך כלל מרצף palindromic קצר באורך של 4-6 זוגות בסיסים, כמו AGCT (עבור Alu I) ו- GAATTC עבור Eco RI.

רצפים Palindromic הם רצפים שלמרות שהם נקראים בכיוון 5 'עד 3' או 3 'עד 5', זהים זה לזה. לדוגמא, במקרה של Eco RI, הרצף הפלינדרומי הוא: GAATTC ו- CTTAAG.

פונקציות ויישומים של endonucles להגבלה

למרבה המזל עבור הביולוגים המולקולריים, חיידקים פיתחו במהלך האבולוציה סדרה של אנדונוקליזות הגבלה המפצחות חומר גנטי פנימי.

בטבע, אנזימים אלה התפתחו - ככל הנראה - כמערכת הגנה על חיידקים מפני פלישת מולקולות DNA זרות, כמו אלו מפאגים.

על מנת להבחין בין חומר גנטי מקומי לזרים, אנדונוקליזות מגבלות אלה יכולות לזהות רצפי נוקלאוטידים ספציפיים. כך, ניתן להפריע ב- DNA שאין לו רצף זה בתוך החיידק.

לעומת זאת, כאשר האנדונוקליז מזהה את אתר ההגבלה, הוא נקשר ל- DNA וחותך אותו.

הביולוגים מעוניינים ללמוד את החומר הגנטי של היצורים החיים. עם זאת, ה- DNA מורכב מכמה מיליוני זוגות בסיסים. מולקולות אלה ארוכות ביותר ויש לנתח אותן בשברים קטנים.

כדי לעמוד ביעד זה, אנדונוקליזות מגבלות משולבות בפרוטוקולים השונים של הביולוגיה המולקולרית. לדוגמה, ניתן לתפוס גן בודד ולשכפל אותו לניתוח עתידי. תהליך זה מכונה "שיבוט" גן.

פולימורפיזם באורך שבר הגבלה (RFLP)

פולימורפיזם של אורך שבר-הגבלה מתייחס לדפוס של רצפי נוקליאוטידים ספציפיים ב- DNA שמגבלות אנדונוקליזות מסוגלות לזהות ולחתוך.

בזכות הספציפיות של האנזימים, כל אורגניזם מאופיין בתבנית חתך ספציפית ב- DNA, שמקורם בשברים באורכים משתנים.

סוגים של אנדונוקליזות מגבלות

מבחינה היסטורית, אנדונוקליזות מגבלות סווגו לשלושה סוגים של אנזימים, המיועדים על ידי ספרות רומיות. לאחרונה תואר סוג רביעי של אנדונוקליז.

סוג I

המאפיין החשוב ביותר של אנדונוקליזות מסוג I הוא שמדובר בחלבונים המורכבים מכמה תת-יחידות. כל אחד מאלו מתפקד כמכלול חלבון יחיד ובדרך כלל יש לו שתי יחידות משנה הנקראות R, שתי M ואחת S.

חלק ה- S אחראי על ההכרה באתר ההגבלה ב- DNA. יחידת המשנה R, מצידה, חיונית לסיווג ו- M אחראית לזרז את תגובת המתילציה.

ישנן ארבע קטגוריות משנה של אנזימים מסוג I הידועים באותיות A, B, C ו- D שנמצאים בשימוש נפוץ. סיווג זה מבוסס על השלמה גנטית.

אנזימים מסוג I היו האנדונוקליזות המגבלות הראשונות שהתגלו וטוהרו. עם זאת, השימושיים ביותר בביולוגיה מולקולרית הם סוג II, אשר יתואר בחלק הבא.

סוג II

אנדונוקליזות מגבלות מסוג II מזהות רצפי DNA ספציפיים ומחשוף במיקום קבוע קרוב לרצף שמייצר 5 'פוספטים ו -3' הידרוקסיליים. בדרך כלל הם זקוקים ליוני מגנזיום (Mg ²⁺ ) כקופקטורים , אך ישנם כאלה שיש להם דרישות ספציפיות הרבה יותר.

מבחינה מבנית הם יכולים להופיע כמונומרים, דימר או אפילו טטרררים. טכנולוגיה רקומביננטית משתמשת באנדונוקליזות מסוג II ומסיבה זו אופיינו יותר מ- 3,500 אנזימים.

סוג III

מערכות אנזימטיות אלה מורכבות משני גנים, הנקראים mod and res, המקודדים לתת-היחידות שמזהות DNA ולשינויים או מגבלות. שתי יחידות המשנה נחוצות להגבלה, תהליך תלוי לחלוטין בהידרוליזה של ATP.

על מנת לקטר את מולקולת ה- DNA, על האנזים לקיים אינטראקציה עם שני עותקים של רצף הזיהוי הלא-palindromic והאתרים חייבים להיות בכיוון הפוך על המצע. לפני המחשוף קודר טרנסלוקציה של DNA.

סוג IV

לאחרונה זוהתה קבוצה נוספת. המערכת מורכבת משני גנים או יותר המקודדים לחלבונים החוסקים רק רצפי DNA שהשתנו, או מתוקי, הידרוקסי-מתילתי או גלוקוזיל הידרוא-מתילתי.

לדוגמה, האנזים EckKMcrBC מזהה שני דינוקלוטידים מהצורה הכללית RmC; פורין ואחריו ציטוזין מתילתי, אותו ניתן להפריד על ידי מספר זוגות בסיסים - בין 40 לכמעט 3000. המחשוף מתרחש כ- 30 זוגות בסיס לאחר האתר אותו מזהה האנזים.

אנדונוקליזות מסוג V

אנדונוקליזות מסוג זה מכונות גם "אנדונוקליזות". אנזימים אלה מזהים וחותכים את רצף ה- DNA היעד באתרים ייחודיים בגנום בין 14 ל- 40 נ"ז.

אנזימים אלה מקודדים לעיתים קרובות באינטרונים ותפקידם אמור להיות קידום העברה אופקית של רצפי חתך. לאחר החיתוך מתרחש תיקון שבירה בסליל הכפול של ה- DNA על בסיס הרצף המשלים.

דוגמאות

אנדונוקליזה I מאי קולי פועלת כמערכת הגנה מפני פאגים וטפילים. הוא ממוקם בעיקר בין הממברנה הציטופלסמית לדופן התא. הוא מייצר הפסקות גדולות כפולות ב- DNA הזר איתו הוא מתקשר במרחב הפריפלזמי.

אנדונוקליזות CRISPR-Cas הם אנזימים הפועלים על מנגנון ההגנה של סוגים רבים של חיידקים. אלה מזהים וחותכים רצפי DNA ספציפיים מאורגניזמים פולשים, שהם בדרך כלל נגיפים.

לאחרונה גילו חוקרים במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס (MIT) את מערכת העריכה הגנונית CRISPR-Cas12bm בדיוק רב לשינוי תאים אנושיים.

הפניות

1. בורל, מ.מ (עורכת). (1993). אנזימים של ביולוגיה מולקולרית. Totowa, NJ: הומאנה הוצ '.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). אנזימי הגבלה מסוג I וקרוביהם. מחקר חומצות גרעין, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). מיקרוביולוגיה רפואית + סטודנט קונסולט בספרדית + סטודנט קונסולט. מדעי הבריאות Elsevier.
4. Nathans, D., and Smith, HO (1975). מגבלות אנדונוקליזות בניתוח ושינוי מבנה של מולקולות DNA. סקירה שנתית של ביוכימיה, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). אנדונוקליזות מגבלות מסוג II: מבנה ומנגנון. מדעי החיים הסלולריים והמולקולריים, 62 (6), 685.