ציטוכימיה: היסטוריה, מושא המחקר, תועלת וטכניקות - ביולוגיה - 2025

Cytochemistry כוללת סדרה של טכניקות אשר מסתמכות על זיהוי הנטייה של חומרים ספציפיים בתוך התא. זה נחשב לענף של ביולוגיה של התא המשלב מורפולוגיה של תאים עם מבנה כימי.

לדברי בנסלי, מייסד היישום של ציטולוגיה מודרנית, מביע כי מטרת הציטוכימיה היא לגלות את ההתארגנות הכימית של התאים על מנת להבין את תעלומות החיים. כמו כן חקר השינויים הדינאמיים המתרחשים בשלבים הפונקציונליים השונים.

1: מחלתו החיצונית של פאג'ט. (Hematoxylin-Eosin) 2: פלאק סנילי שנצפה בקליפת המוח אצל חולה במחלת אלצהיימר. (הספגה מכסף) 3: לשון ארנב, סיבי קולגן (כחול). סיבי שריר (רצועות סגולות). (הטריכרום של מסון). 4: רקמת כבד עם ניוון שומני. (סודן השלישי) 5: כבד מודלק. נֶמֶק. (כחול טולידיני) מקורות: ויקיפדיה. co.il / משתמש: KGH / קבצי תחום ציבורי / מוהיט לוווואני

בדרך זו ניתן לקבוע את התפקיד המטבולי שממלאים חומרים אלו בתא.

ציטוכימיה עושה שימוש בשתי שיטות עיקריות. הראשון מבוסס על נהלים כימיים ופיזיים. טכניקות אלה נוקטות בשימוש במיקרוסקופ כמכשיר חיוני בכדי להמחיש את התגובות הכימיות המתרחשות על חומרים ספציפיים בתא.

דוגמא: שימוש בצבעים ציטוכימיים, כמו תגובת Feulgen או תגובת PAS, בין היתר.

השיטה השנייה מבוססת על ביוכימיה ומיקרוכימיה. בעזרת מתודולוגיה זו ניתן לקבוע כמותית את נוכחותם של כימיקלים תוך תאיים.

בין החומרים שניתן לחשוף במבנה רקמות או תאים ניתן למצוא את הבאים: חלבונים, חומצות גרעין, פוליסכרידים וליפידים.

היסטוריה של ציטוכימיה

טכניקות ציטו-כימיות מאז המצאתן עזרו להבין את הרכב התאים, ועם הזמן צצו מגוון טכניקות המשתמשות בסוגים שונים של צבעים בעלי זיקות ובסיסים שונים.

בהמשך, הציטוכימיה פתחה אופקים חדשים בעזרת מצעים מסוימים כדי להראות בקולומטרית את נוכחותם של אנזימים או מולקולות אחרות בתא.

כמו כן, התפתחו טכניקות אחרות כמו אימונוציטוכימיה שעזרו מאוד באבחון מחלות רבות. אימונוציטוכימיה מבוססת על תגובות נוגדן-נוגדנים.

מצד שני, הציטוכימיה השתמשה גם בחומרים ניאון הנקראים פלואורוכרומים, שהם סמנים מצוינים לגילוי מבני תאים מסוימים. בשל המאפיינים של הפלואורוכרום הוא מדגיש את המבנים אליהם הוא נקשר.

מה אתה לומד?

לטכניקות הציטוכימיות השונות המשמשות במדגם ביולוגי יש משהו משותף: הן חושפות נוכחות של חומר ספציפי ויודעות את מיקומו במבנה הביולוגי הנבדק, בין אם מדובר בסוג תא או ברקמה.

חומרים אלה יכולים להיות אנזימים, מתכות כבדות, ליפידים, גליקוגן וקבוצות כימיות מוגדרות (אלדהידים, טירוזין וכו ').

המידע המסופק על ידי טכניקות אלה יכול לספק הדרכה לא רק לזיהוי תאים, אלא גם לאבחון פתולוגיות שונות.

לדוגמא, כתמים ציטוכימיים מועילים מאוד להבדיל בין סוגי הלוקמיה השונים, מכיוון שתאים מסוימים מבטאים אנזימים מסוימים או חומרים מרכזיים ואחרים אינם.

מצד שני, יש לציין שעל מנת שניתן יהיה להשתמש בציטוכימיה יש לקחת את השיקולים הבאים:

1) יש לאתר את החומר במקום בו הוא נמצא באופן טבעי.

2) יש לזהות את החומר באמצעות מצעים המגיבים באופן ספציפי אליו ולא עם תרכובות אחרות.

תוֹעֶלֶת

הדגימות שניתן ללמוד באמצעות טכניקות ציטוכימיות הן:

- דם היקפי מורחב.

- מוח עצם מורחב.

- רקמות קבועות לטכניקות היסטוכימיות.

- תאים קבועים על ידי ציטוצנטריפוגה.

טכניקות ציטוכימיות תומכות מאוד בתחום ההמטולוגיה, מכיוון שהן משמשות לרוב באבחון ובידול של סוגים מסוימים של לוקמיה.

לדוגמא: תגובות אסטראז משמשות כדי להבדיל בין לוקמיה מיאלומונוציטית לבין לוקמיה מונוציטית חריפה.

מריחת מוח העצם וריח הדם ההיקפי מחולים אלה דומים, מכיוון שתאים מסוימים מתקשים לזהות מורפולוגית בלבד. לשם כך מבוצעת בדיקת האסטרז.

בראשון, אסטרזות ספציפיות הן חיוביות, ואילו בשני, אסטרזות לא ספציפיות חיוביות.

הם מועילים מאוד גם בהיסטולוגיה, שכן, למשל, השימוש בטכניקת הכתמת המתכת הכבדה (הספגת כסף) מכתים את סיבי הרשתית בצבע חום עז ברקמת שריר הלב.

טכניקות בציטוכימיה

הטכניקות הנפוצות ביותר יוסברו להלן:

- שימוש בצבעים

הכתמים המשמשים הם מגוונים מאוד בטכניקות ציטוכימיות וניתן לסווג אותם לפי כמה נקודות מבט:

לפי הרדיקלי שעבורו יש להם זיקה

הם מחולקים ל: חומצי, בסיסי או ניטרלי. הם הפשוטים והמשתמשים ביותר לאורך ההיסטוריה, ומאפשרים לנו להבדיל בין המרכיבים הבסופיליים לבין החמצני. דוגמא: מכתים המטוקילין-אאוסין.

במקרה זה, גרעיני התאים מכתימים כחולים (הם לוקחים המטוקסילין, שהוא הצבע הבסיסי) והציטופלזמה, אדומה (הם לוקחים eosin, שהוא הצבע החומצי).

לפי הצבע שהם מספקים

הם יכולים להיות אורתוכרומטיים או מטכרומטיים. האורתוכרומטים הם אלה שמכתים את המבנים באותו צבע שיש לצבוע. לדוגמא, המקרה של eosin, שצבעו אדום וכתמים אדומים.

מצד שני, מטאכרומטיקה מכתימה מבנים בצבע שונה משלם, כמו טולידין, שצבעו כחול ועם זאת כתמים סגולים.

צבעים חיוניים או בעלי חיים רב-טבעיים

מדובר בצבעים לא מזיקים, כלומר הם צובעים תאים והם נשארים בחיים. כתמים אלה נקראים חיוניים (למשל כחול טריפאן עד להכתמת מקרופאגים) או סופר-טבעיים (למשל יאנוס ירוק עד כתם של מיטוכונדריה או אדום נייטרלי לכתמי ליזוזומים).

- איתור ליפידים באמצעות צבעים מסיסים בשומן

אוסמיום טטרוקסיד

זה מכתים שומנים (חומצות שומן בלתי רוויות) בשחור. ניתן להבחין בתגובה זו באמצעות מיקרוסקופ האור, אך מכיוון שצבע זה בצפיפות גבוהה ניתן לדמיין אותו גם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים.

סודן השלישי

זהו אחד המשומשים ביותר. צבע זה מתפזר וממסיס ברקמות, המצטבר בתוך טיפות השומנים. הצבע אדום ארגמן.

כתם שחור סודני B

זה מייצר ניגודיות טובה יותר מהקודמות מכיוון שהוא מסוגל להתמוסס גם בזרחן וכולסטרול. זה שימושי לגילוי גרגירים אזורופיליים וספציפיים של גרנולוציטים בוגרים ומבשריהם. לכן זה מזהה לוקמיה מיאלואידית.

- מכתים בקבוצת אלדהיד (כתם שיף של חומצה תקופתית)

כתם שיף של חומצה תקופתית יכול לגלות שלושה סוגים של קבוצות אלדהיד. הם:

- אלדהידים חופשיים, הקיימים באופן טבעי ברקמות (תגובה פלזמה).

- אלדהידים המיוצרים על ידי חמצון סלקטיבי (תגובת PAS).

- אלדהידים הנוצרים על ידי הידרוליזה סלקטיבית (תגובת Feulgen).

תגובת PAS

מכתים זה מבוסס על איתור סוגים מסוימים של פחמימות, כגון גליקוגן. חומצה תקופתית שיף מפרק את קשרי ה- CC של הפחמימות עקב חמצון של קבוצות גליקוליות 1-2, ומצליח לשחרר קבוצות אלדהיד.

קבוצות אלדהיד חופשיות מגיבות עם המגיב של שיף ויוצרים תרכובת אדומה-סגולה. מראה הצבע הסגול-אדום מראה תגובה חיובית.

בדיקה זו חיובית בתאי צמחים, גילוי עמילן, תאית, המיסלולוזה ופפטינים. בעוד שבתאים בבעלי חיים הוא מגלה ריריות, מוקופרוטאינים, חומצה היאלורונית וכיטין.

בנוסף, זה מועיל באבחון של לוקמיה לימפובלסטית או אריתולוקמיה, בין פתולוגיות אחרות מהסוג myelodysplastic.

במקרה של פחמימות חומציות ניתן להשתמש בכתם הכחול האלקי. הבדיקה חיובית אם נצפה צבע כחול בהיר / טורקיז.

תגובה פלסמלית

תגובת הפלזמה חושפת את נוכחותם של אלדהידים אליפטיים ארוכי שרשרת מסוימים כמו כף היד וסטאראלי. טכניקה זו מיושמת על קטעים היסטולוגיים קפואים. הוא מטופל ישירות עם המגיב של שיף.

תגובה של פולגן

טכניקה זו מגלה נוכחות של DNA. הטכניקה מורכבת מהכנת הרקמה הקבועה להידרוליזה חלשה של חומצה כדי לגרום לה בהמשך להגיב עם המגיב של שיף.

ההידרוליזה חושפת את קבוצות האלכוהול deoxyribose בקישור הצומח deoxyribose-purine. המגיב של שיף מגיב אז עם קבוצות האלדהיד שנשארו חופשיות.

תגובה זו חיובית בגרעינים ושלילית בציטופלסמות התאים. הוכחה שהפוזיציות נוכחות של צבע אדום.

אם טכניקה זו משולבת במתיל ירוק-פירונין, ניתן לאתר בו זמנית DNA ו- RNA.

- כתמים ציטוכימיים למבני חלבון

לשם כך ניתן להשתמש בתגובת המילון המשתמשת בכספית חנקה כריגנט. מבנים המכילים חומצות אמיניות ארומטיות יכתמו אדום.

- כתמים ציטוכימיים המשתמשים במצעים בכדי להראות נוכחות של אנזימים

כתמים אלה מבוססים על דגירה של הדגימה הביולוגית עם מצע מסוים ותוצר התגובה לאחר מכן מגיב עם מלחי דיאזו ליצירת קומפלקס צבעוני.

אסטראזות

אנזימים אלו קיימים בליזוזומים של חלק מתאי הדם והם מסוגלים לבצע הידרוליזה של אסטרים אורגניים המשחררים את נפטול. זה האחרון יוצר צבע אזו בלתי מסיס כשהוא נקשר למלח דיאוז, ומכתים את המקום בו מתרחשת התגובה.

ישנם מספר מצעים ובהתאם לאילו משתמשים, ניתן לזהות אסטרזות ספציפיות ואסתרזות לא ספציפיות. הראשונים קיימים בתאים לא בשלים מסדרת myeloid והאחרונים בתאים ממוצא מונוציטי.

המצע המשמש לקביעת אסטרזות ספציפיות הוא: naphthol-AS-D chloroacetate. בעוד לקביעת אסטרזות לא ספציפיות ניתן להשתמש במספר מצעים כגון נפטול AS-D אצטט, אלפא נפתיל אצטט ואלפא נפטיל בוטיראט.

בשני המקרים התאים יכתים אדום עמוק כאשר התגובה חיובית.

מיאלופרוקסידאז

אנזים זה נמצא בגרגירים אזורופיליים של תאים גרנולוציטים ומונוציטים.

איתורו משמש כדי להבדיל בין לוקמיה ממקור מיאלואידי לבין אלה לימפואידים. תאים המכילים מיאלופרוקסידזות הופכים לצהובים יותר.

פוספטאזים

אנזימים אלה משחררים חומצות זרחן ממצעים שונים. הם נבדלים זה מזה על פי הספציפיות של המצע, ה- pH והפעולה של מעכבים וחומרים פעילים.

בין הידועים ביותר הם הפוספונומואסטראזים הממצים הידרוליזה של אסטרים פשוטים (PO). דוגמה: פוספטז אלקליין ופוספטאז חומצי, כמו גם פוספידאזים שממצים הידרוליזציה של הקשרים (PN). אלה משמשים להבחנה בין תסמונות לימפופרוליפרטיביות ולאבחון של לוקמיה בתאים שעירים.

- צבעי טריכומיה

טריכרום של מאלרי-אזן

הם מועילים להבדיל את הציטופלסמה של תאים מסיבי רקמת החיבור. תאים מוכתמים בסיבי אדום וסיבי קולגן כחולים.

הטריכרום של מסון

יש לזה תועלת זהה לזו שקדמה לה, אך במקרה זה, התאים מכתים אדום וסיבי הקולגן ירוקים.

- צבעים המכתים אברונים ספציפיים

יאנוס גרין

זה מכתים באופן סלקטיבי את המיטוכונדריה.

מלחי כסף וחומצה אוסמית

מתנגד למנגנון גולגי.

כחול טולידיני

מכתים את גופותיו של ניסי

מלחי כסף ו- PAS

הם מכתימים את סיבי הרשתית ואת הלמינה הבסיסית.

אורסין ופוקסין resorcin

הם צובעים סיבים אלסטיים. עם הראשון הם צבועים בצבע חום ועם השני כחול עמוק או סגול.

- טכניקות אחרות המשמשות בציטוכימיה

שימוש בחומרים ניאון או פלואורוכרומים

ישנן טכניקות שמשתמשות בחומרים ניאון כדי לחקור את מיקום המבנה בתא. תגובות אלה מוצגות באמצעות מיקרוסקופ מיוחד הנקרא פלואורסצנט. דוגמה: טכניקת IFI (עקיפה פלואורסצנטית עקיפה).

איתור רכיבים סלולריים על ידי אימונוציטוכימיה

טכניקות אלה מועילות מאוד ברפואה שכן הן מסייעות לאיתור מבנה תאים מסוים וגם לכימות אותו. תגובה זו מבוססת על תגובה נוגדן-נוגדן. לדוגמא: טכניקות ELISA (אנזים Immuno Assay).

המלצות

- יש צורך להשתמש במריחי בקרה כדי להעריך את הביצועים הטובים של הצבעים.

- יש להשתמש במריחות טריות כדי לעבור מכתים ציטוכימיים. אם זה לא אפשרי, יש לשמור עליהם מוגנים מפני אור ואוחסנים ב -4 מעלות צלזיוס.

- יש להקפיד כי הקיבוע בו נעשה שימוש לא ישפיע לרעה על החומר הנבדק. במילים אחרות, יש למנוע ממנו אפשרות לחלץ או לעכב אותו.

- יש לכבד את זמן השימוש בחומרי הקבע, מכיוון שבאופן כללי הוא צריך להימשך שניות בלבד, שכן חשיפת המריחה לאורך זמן לקיבוע עלולה לפגוע באנזימים מסוימים.

הפניות

1. "ציטוכימיה." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 30 יוני 2018, 17:34 UTC. 9 יולי 2019, 02:53 זמין ב: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. שיטות הספגה מתכית לחקר סיבי רשתית שריר הלב: מחקר השוואתי. RFM 2002; 25 (2): 224-230. ניתן להשיג ב: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. ציטוכימיה של חומצה פוספטאז: שיקולים מתודולוגיים. הכומר דיאג ביול. 200; 50 (2): 89-92. ניתן להשיג ב: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). ביולוגיה תאית ומולקולרית. מהדורה 11. עורכי דין אטנו. בואנוס איירס, ארגנטינה.
5. כלים קלאסיים ללימוד ביולוגיה של התא. TP 1 (חומר משלים) - ביולוגיה של התא. ניתן להשיג ב: dbbe.fcen.uba.ar