חיץ פוספטים (PBS): רציונל, הכנה ושימושים - ביולוגיה - 2025

חיץ פוספט, בופר פוספט או BPS הוא חיץ איזוטוני, שתפקידו כדי לשמור על pH ואת הלחץ האוסמוטי קרוב לסביבה הביולוגית הטבעית (פיזיולוגי). ראשי התיבות PBS מיועדים למלח חיץ עם זרחן.

PH ואוסמולולריות הם שני היבטים חשובים מאוד שיש לשלוט בפרוטוקולים מסוימים במעבדה. במקרה של pH, חיוני שהוא יהיה מבוקר, במיוחד בתגובות ביוכימיות, מכיוון שאלו עשויות להשתנות או לא להתבצע אם המגיבים נמצאים ב pH לא מתאים.

מלוחים מאגרים פוספטים PBS בשני pH pH שונים. מקור: Pixinio.com

בינתיים, השליטה באוסמולולריות חיונית במיוחד בעבודה עם תאים חיים, שכן קרומי הפלזמה של התאים מגיבים בהתאם לריכוז המומסים בהם הם נמצאים.

אם התאים מועברים למדיום היפרטוני הם יתייבשו, מכיוון שיפוע המים יועבר לצד בו יש ריכוז גבוה יותר של מומסים. אם, לעומת זאת, התאים ממוקמים במדיום היפוטוני, התאים יספגו נוזלים עד להעלאתם.

זו הסיבה שמאגר PBS משמש לפרוטוקולים במעבדה המחייבים תחזוקה של תאים במבחנה, בדרך זו התאים לא ייפגעו.

PBS מורכב משילוב של מלחים, כמו נתרן כלוריד, נתרן פוספט, אשלגן כלוריד ואשלגן פוספט. הרכב ה- PBS יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול.

בָּסִיס

בעיקרון תפקידו של מלח החיץ הפוספט הוא לשמור על pH פיזיולוגי קבוע יחד עם ריכוז אלקטרוליטים דומה לזה שנמצא בגוף.

בסביבה זו, התאים מסוגלים להישאר יציבים, מכיוון שמדמים מצבים פיזיולוגיים ככל האפשר.

ניתן להוסיף תרכובות אחרות לפורמולציה המקורית של PBS במידת הצורך, למשל תוספת של EDTA לחיץ מועילה לשטיפת תאי דם אדומים במבחן ההתאמה הצולבת.

EDTA מונע את השבר של החלק המשלים C1 שנמצא בסרום מישבק ומוחזק לתאי הדם האדומים, כלומר הוא נמנע מתוצאות אי התאמה כוזבות. בנוסף, EDTA מסייע בהפרדת תאים.

הכנה

כמות המלחים שחייבים לשקול לצורך הכנת המלח המוחץ עם פוספט PBS תלויה בכמות שיש להכין:

פתרון מלאי מלוחים עם פוספט (10X PBS)

עבור ליטר אחד של פתרון:

לשקול:

80.6 גרם NaCl,

2.2 גרם KCl,

11.5 גרם Na ₂ HPO ₄ ,

2.0 גרם KH ₂ HPO ₄

טכניקת הכנה

הניחו את המלחים הכבדים בספל, הוסיפו מספיק מים (80%) וערבבו על צלחת הבחישה עם מוט מגנטי עד להמסת המלחים.

הכנת PBS בעזרת צלחת בחישה עם מוט מגנטי. מקור: משתמש: Ruhrfisch, Wikipedia. com

סנן כדי להסיר חלקיקים לא מומסים. השתמש בפילטרים עם נקבוביות 0.45 מיקרומטר. החיטוי והפצה אוטומטית במכסה זרימה למינרית בצנצנות זכוכית עם מכסים.

תמיסת 10X (מרוכזת) אינה מכוונת את החומציות. ההתאמה נעשית ברגע שמדלול לריכוז החיץ של 1X PBS, (דילול 1:10).

- מלח פוספט במאגר (1X PBS)

ניתן להכין 1X PBS ישירות, שוקל את הכמויות המתאימות של כל מלח, או שניתן להכין אותו על ידי דילול של תמיסת המניות (1:10) במים מזוקקים סטריליים.

-כדי להכין ישירות ליטר אחד של מלח מלחץ זרוע 1X PBS, שוקל:

8.06 גרם NaCl,

0.22 גרם KCl,

1.15 גרם Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 גרם KH ₂ HPO ₄

טכניקת הכנה

המשך כמוסבר בתמיסה המרוכזת. לאחר מכן, יש להתאים את ה- pH. לשם כך, נמדד את ה- pH ובהתאם לתוצאה השתמש בחומצה (HCl) או בסיס (NaOH) כדי להוריד או להעלות את ה- pH בהתאמה בהתאם לצורך, עד שהוא 7.4.

החומצה או הבסיס מוסיפים טיפה אחר טיפה תוך פיקוח על ערך החומציות של התמיסה באמצעות מד pH. סנן, החיטוי והפצה בצורה אספטית לצינורות או צנצנות חרוטי לפי הצורך.

-להכין 1X PBS מפיתרון המניות 10X:

בצע דילול של 1:10. לדוגמה, להכנת 1 ליטר של 1X PBS, יש למדוד 100 מ"ל מתמיסת הציר ולהוסיף 700 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. התאם את החומציות ומלא את כמות המים עד 1000 מ"ל.

מאגר ה- PBS המוכן חסר צבע וברור.

ניתן לאחסן PBS יומי בטמפרטורת החדר והשאר במקרר.

פתרונות להתאמת pH

HCl

עבור 100 מ"ל של HCL טוחני 1 (חומצה הידרוכלורית).

מדדו 91 מ"ל מים מזוקקים והניחו בספל 250 מ"ל.

מודדים 8.62 מ"ל של HCl מרוכז ומוסיפים אותו לאט לאט לכוס המכיל את המים (לעולם אל תעשה זאת להפך). יש לנקוט באמצעים הבטיחות הביולוגית המתאימה בעת טיפול בחומצות חזקות (חומר מאכל מאוד).

מערבבים במשך 5 דקות רצוי בעזרת צלחת בחישה עם מוט מגנטי בתוך הכוס. מעבירים לבקבוק 100 מ"ל וממלאים עד 100 מ"ל עם H ₂ O מזוקק.

NaOH

עבור 100 מ"ל של NaOH (נתרן הידרוקסיד) 10 טוחנות.

מדדו 40 מ"ל מים מזוקקים והניחו בספל 250 מ"ל. מודדים 40 גרם NaOH ומוסיפים למים. מערבבים בעזרת צלחת ערבוב עם מוט מגנטי בתוך הזכוכית.

מעבירים לבקבוק נפח של 100 מ"ל וממלאים את הסימן עם מים מזוקקים. יש לציית לתקנות הבטיחות הבטיחות, מכיוון שתגובה זו אקסותרמית (היא משחררת אנרגיה בצורה של חום).

אם ברצונך להכין כמויות אחרות של תמיסת מלח פוספט, תוכל להתייעץ בטבלה הבאה:

המקור: «מעבדה לגנום אנושי, בית הספר לרפואה של UASLP»

יישומים

הוא משמש בעיקר בביולוגיה של תאים, אימונולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, בקטריולוגיה, וירולוגיה ומעבדות מחקר.

זה אידיאלי לשטיפת תאים על ידי צנטריפוגה (תאי דם אדומים), שוטף חד-שכבתי תאים, בטכניקות אליפסומטריה ספקטרוסקופית, בכימות biofilms חיידקים, בתחזוקה של תרביות תאים לנגיפים, כפתרון שטיפה בטכניקת החיסון העקיף העקיף. ובטכניקות לאפיון נוגדנים מונוקלוניים.

הוא משמש גם להובלת תאים או רקמות, כדילול לספירת תאים, להכנת אנזימים תאיים (טריפסין), כדילול לשיטת הייבוש ביומולקולה ולהכנת ריאגנטים אחרים.

לעומת זאת, מרטין ואח 'בשנת 2006 הראו כי PBS מועיל במעבדות מדעיות משפטיות, במיוחד בהתאוששות זרע מריחות בנרתיק, או בהתאוששות תאי הנרתיק ממריחות פין. בדרך זו ניתן לקבוע אם היה קשר מיני.

מגבלות

- כמה מאגרי PBS מכילים חומר הנקרא נתרן אזיד כחומר משמר. תרכובת זו יכולה ליצור חומרים נפיצים אם היא באה במגע עם עופרת או נחושת. מסיבה זו יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת השלכת מגיב זה לניקוז. אם הוא מושלך בדרך זו, יש להוסיף הרבה מים כדי לדלל אותם ככל האפשר.

אין להוסיף אבץ למאגר הפוספטים, מכיוון שהוא גורם לכמה מלחים לזרז.

ונגן ומשתפי הפעולה בשנת 2018 קבעו כי השימוש ב- PBS לא מתאים לשטיפת תאים ראשוניים של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) המופקת מדם היקפי, בשל העובדה כי תאים רבים הולכים לאיבוד בגלל תמוגה, עם ירידה רבה בחומר חֶלְבּוֹן.

לכן הם קבעו כי אין לכבס תאי AML ראשוניים עם PBS לאחר האחסון בחנקן נוזלי.

הפניות

1. קול ג'יי (1993). טכניקות אבחון בוויראולוגיה. אד דיאז דה סנטוס. 360 עמ '
2. Rodríguez M, Ortiz T. תרבית תאים. שינוי בינוני. המחלקה לציטולוגיה רגילה ופתולוגית והיסטולוגיה אוניברסיטת סביליה. ניתן להשיג ב personal.us.es
3. הכנת מלוחים מאוכלים פוספטיים (PBS). (2008). נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) בית הספר לרפואה במעבדת הגנומיקה האנושית והנגיפית UASLP. ניתן להשיג ב: genomica.uaslp.mx
4. "מלח חיץ פוספט." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 3 אפריל 2019, 19:36 UTC. 13 אפריל 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. נושאים בביופיזיקה מולקולרית. זמין ב: users.df.uba.ar
6. Rediar. מדריך ל. PBS + EDTA. ניתן להשיג ב: felsan.com.ar
7. מרטין NC, פירי AA, פורד LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. השימוש במי מלח עם פוספט להתאוששות התאים והזרע מספוגים. מדע הצדק. 2006; 46 (3): 179-84. ניתן להשיג ב: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. שיטת שימור וכביסה במלח מלוחים עם זרחן משפיעים על חלבון הלוקמיה המיאלואידית החריפה. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. ניתן להשיג ב: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). יסודות תיאורטיים ומעשיים של היסטוכימיה. מועצת החקירות המדעיות העליונה. מדריד. זמין בכתובת: books.google.co.ve