רצף DNA: מקסם גילברט, שיטה ודוגמאות - ביולוגיה - 2025

רצפי DNA (חומצה דאוקסיריבונוקלאית) היא הליך במעבדות הביולוגיה המולקולרית המאפשר כדי לדעת את סדר נוקלאוטידים בחומר הגנטי של עניין. יתר על כן, ניתן לחשוף גם את רצף RNA (חומצה ריבונוקלאית).

טכניקה זו הייתה הכרחית להתפתחות מדעי הביולוגיה. זה תקף גם לתחומי ידע אחרים - כגון אבחון רפואי וחקירות משפטיות, למשל.

מקור: pixabay.com

בעבר, רצף גדיל ה- DNA נחשב לפעילות איטית ויקרה, שאפשרה לזהות רק כמה זוגות בסיס באוליגונוקליאוטידים.

כיום, עם כל ההתקדמות במדע, רצף DNA הוא פעולה שגרתית במעבדות רבות ברחבי העולם בזכות תרומתם של כמעט 50 שנות מחקר בתחום זה. מבחינת אורך השרשרת, ניתן לרצף עד מיליוני זוגות בסיסים תוך זמן קצר מאוד.

לשם כך ישנן עשרות טכניקות שפותחו ומשתנות במחיר ודיוק. במאמר זה נתאר טכניקות קלאסיות ומודרניות כאחד, לכל אחד היתרונות והחסרונות שלה.

עד כה, טכניקות רצף מאפשרות להשיג את רצף הגנומים השלמים, החל מפרוקריוטים קטנים ושמרים ועד לגנום האנושי.

מבנה DNA

כדי להבין את השיטות והטכניקות המשמשות לרצף DNA, יש צורך לדעת היבטים מרכזיים מסוימים של מבנה המולקולה והרכבה.

DNA הוא ביו-מולקולה הנמצאת בכל היצורים החיים, מחיידקים ועד בעלי חיים ימיים גדולים. באורגנלים - כמו מיטוכונדריה וכלורופלסטים - יש בתוכם מולקולת DNA מעגלית. אפילו בנגיפים מסוימים, החומר הגנטי שנמצא הוא DNA.

מבחינה מבנית, DNA הוא אוסף של נוקלאוטידים. כל אחד מהם מורכב מפחמימות, בסיס חנקני (A, T, C או G) וקבוצת פוספטים. מטרת רצף ה- DNA היא לחשוף את הסדר בו נמצאים ארבעת הבסיסים החנקניים ברצף.

הִיסטוֹרִיָה

באמצע שנות החמישים, תיארו החוקרים ווטסון וקריק את מבנה ה- DNA בטכניקות נוצריות. עם זאת, אף אחד מחוקרים אלה לא הצליח למצוא דרך לפרוק את הרצף.

למרות שהיו קודמים מסוימים, האירוע החשוב ביותר היה יצירת שיטת הסנגר, בשנת 1977. פרדריק סנגר, אבי השיטה, היה ביוכימאי בריטי, זוכה בשני פרסי נובל על תרומותיו העצומות למדעים הביולוגיים.

טכניקה זו ידועה בספרות גם "סיום שרשרת" או דידויקסינוקלאוטידים. עקרונות הטכניקה הזו ואלה שפותחו בהתבסס על שיפור וחדשנותה יתוארו בהמשך.

שיטת סנגר

פיתוח שיטת סנגר ייצג אירוע מכריע בביולוגיה מולקולרית. זה כרוך במרכיבים הבסיסיים בתהליך שכפול ה- DNA המתרחש בדרך כלל בתא, אך הוספת רכיב מיוחד: דידויקסינוקלאוטידים.

המרכיבים העיקריים של התגובה

- פולימראז DNA: האנזים DNA פולימראז הוא מרכיב מכריע בתהליך. מולקולה זו משתתפת בשכפול של גדיל ה- DNA ותפקידה הוא הסינתזה של הגדיל החדש, תוך זיווג בין הדוקסיריבונוקלאוטידים הטריפוספטים לאלה המשלימים.

נזכיר כי ב- DNA, תימינים (T) מתיישרים עם אדנינים (A) דרך שני קשרי מימן, ואילו ציטוזין (C) עושה זאת עם גואנין (G) דרך שלושה קשרים.

- נוקליאוטידים: רצף סנגר כרוך בשני סוגים של נוקלאוטידים, ארבעת ה- 2'-deoxynucleotides (מקוצר כ- dATP, dGTP, dCTP ו- dTTP) וארבעת הדידויקסינוקליוטידים (ddATP, ddGTP, ddCTP ו- ddTTP).

למרות שדידיוקסינוקליאוטידים דומים למונומרים המשולבים בדרך כלל ב- DNA, הם חסרים קבוצה -OH במבנה שלהם. זה בלתי אפשרי להוסיף גרעין חדש לשרשרת.

לכן, כאשר מתווספים נוקלאוטיד מיוחד - באופן אקראי לחלוטין - לשרשרת בהיווצרותה, הסינתזה משותקת. כך, בסוף התגובה, יש שרשראות בגדלים שונים, כל אחת מהן שבה הופסקה התגובה בנקודה אחרת.

באופן ניסיוני מכינים ארבע בדיקות. כל אחד מהם מכיל את ה- DNA המופק מהדגימה הביולוגית המעניינת, נוקלאוטידים תקינים ואחד מארבעת סוגי הנוקלאוטידים המיוחדים. או שהנוקליאוטידים המיוחדים מסומנים בסוג פלואורסצנטי כלשהו (ראה רצף אוטומטי אוטומטית בהמשך).

קריאת התוצאות

השלב הראשון הוא להפריד כל אחת מהשרשראות המסונתזות לפי גודלן. חלקם יהיו ארוכים יותר מאחרים, תלוי היכן שולבו הבסיסים המיוחדים.

ישנן טכניקות ביוכימיות שונות המאפשרות הפרדת רכיבי תערובת תוך שימוש בגודל כמאפיין מפלה. בשיטת סנגר, השרשראות השונות מופרדות באמצעות אלקטרופורזה. בגרסאות המתוחכמות יותר של הטכניקה משתמשים באלקטרופורזה נימית.

כך, הגדילים הארוכים יותר נעים פחות מהווריאציות הקצרות יותר. מערכת זו עוברת אז על ידי קורא שמזהה את הסמן הכלול בכל דידוקסינוקליאוטיד. בדרך זו ניתן לדעת את סדר הרצף.

טכניקת "הדור הראשון" הזו מסוגלת לקרוא שברי DNA שאינם גדולים מ- 1 קילובאז. נכון לעכשיו, שיטת סנגר משמשת במעבדות שונות, בדרך כלל בגרסאות המודרניות שלה. בנוסף, הוא משמש לאישוש התוצאות המתקבלות בטכניקות המורכבות ביותר - אך פחות מדויקות.

רצף אוטומטי

כאשר נדרש רצף בקנה מידה גדול, התהליך מואץ באמצעות אוטומציה. זוהי וריאציה של שיטת סיום שרשרת סנגר, שם הפריימרים מתויגים במוצרי ניאון על מנת להבדיל ביניהם.

בהמשך, המוצר התגובה מופעל באלקטרופורזה - הכל בנתיב יחיד. כאשר כל שבר יוצא מהחלק הסופי של הג'ל, הוא מזוהה במהירות על ידי תיוג הניאון שלו, כאשר שגיאה סביב 1%.

המערכות המתוחכמות ביותר כוללות מערכת של עד 96 צינורות נימים המנוהלים על ידי מחשב המשודך לרובוט. כלומר, ניתן לבדוק 96 דגימות DNA במקביל. לפיכך, התהליך הכרוך באלקטרופורזה וניתוח התוצאות הוא אוטומטי לחלוטין.

ביום אחד מערכות אלה יכולות לרצף עד 550,000 בסיסים. במהלך התהליך, עבודה אנושית אינה נחוצה, לוקח 15 דקות בלבד להתחיל בשיטה.

רצף של מקסם-גילברט

באותה תקופה בה פרסם סנגר את עבודתו, שני חוקרים בשם אלן מקסן וולטר גילברט הצליחו לפתח שיטה נוספת להשגת רצף ה- DNA. השיטה זכתה לפופולריות רבה באותה תקופה, אך לאחר מכן נעקרה מהשיפור בשיטה של ​​סנגר.

בניגוד לשיטת הסנגר, רצף של מקסן וגילברט (או רצף כימי, כידוע) אינו כרוך בתגובות הכלאה. המתודולוגיה מורכבת מתוויות עם חומרים תגוביים בקצה אחד ואחריה תהליך טיהור.

אחד ההיבטים השליליים של טכניקה זו טמון במורכבות העצומה שלה ובשימוש בכימיקלים המסוכנים למשתמש. הפסקות כימיות נוצרות על ידי יישום של DMS, חומצה פורמית, הידרזין והידראזין עם מלחים.

תהליך

הפרוטוקול מתחיל בתיוג בסוף 5 'הגדיל עם סמן הזרחן 32, ואז מתרחש שינוי כימי של בסיס החנקן והוא מופרד. לבסוף מתרחשת המחשוף של האזור הכבד.

ראשית אתה מקצר את המחרוזת שברצונך לרצף לקטעים קטנים יותר. שלב זה מבוצע בעזרת אנזימי הגבלה, אשר גורמים לקצוות בולטים.

בשלב הבא התגובה מתבצעת באמצעות פוספטז אלקליין, שמטרתו לחסל את קבוצת הפוספטים. לפיכך, ניתן להשתמש בקינאז פולינוקלאוטיד לביצוע התיוג.

השרשרת מופרזת (שני הגדילים נפתחים). ואז הכימיקלים מוחלים. תגובות המחשוף הללו נעשות בצורה מבוקרת וידוע אילו סוגים של קשרים כל כימיקלים מיושמים שוברים.

קריאת התוצאות

כמו בשיטת סנגר, קריאת התוצאות כרוכה בהפרדה לפי גודל השרשראות המתקבלות במערכת אלקטרופורזה. מערכות המורכבות מפוליאקרילאמיד מאפשרות לקבל רזולוציה מספקת מאוד לקריאת הג'ל.

רצף המוני

הרצף המסיבי מקיף סדרה של שיטות רומן, מקוצרות ל- NGS, מתוך "Next Generation Sequencing" האנגלית.

השיטות המסווגות כ- NGS דורשות שלב הגברה של DNA קודם (הן אינן עובדות עם מולקולה אחת). יתר על כן, הפלטפורמות בהן נעשה שימוש שונות מאוד. עקרונות השיטות הפופולריות ביותר יתוארו להלן:

פירנוסקוונסינג

זה כרוך במעקב אחר שחרורו של פירופוספט, המתרחש בכל פעם שמוסיפים נוקלאוטיד חדש לחוט ה- DNA. מערכת אנזימים משולבת, כך שפליטת האור (הניתנת לזיהוי באמצעות מצלמה) מתרחשת בכל פעם שמשולבים נוקליאוטיד חדש.

התהליך מתחיל בדגירה נפרדת של כל בסיס חנקן כדי לאמת אם יש פליטת אור או לא. Pyrosequencing יכול לקרוא קווצות ארוכות, אך שיעור השגיאות שנמצא הוא גבוה.

רצף סינתזה

זה כרוך בשילוב של נוקלאוטידים שכותרתו. רכיבים פלואורסצנטיים אלה מתווספים, נשטפים, וצוין את הנוקלאוטיד המשולב. לאחר מכן, תווית הנוקלאוטידים מוסרת, וסינתזת הגדיל יכולה להמשיך. בשלב הבא ישולב גם נוקלאוטיד שכותרתו, והצעדים הנזכרים יחזרו על עצמם.

חיסרון לטכניקה זו מתרחש כאשר סמני הניאון אינם מוסרים לחלוטין. פליטות אלה יוצרות טעויות רקע, וכתוצאה מכך טעויות משמעותיות.

רצף קשירה

טכניקה זו שונה מהאחרות, מכיוון שהיא אינה משתמשת בפולימראז DNA. במקום זאת, האנזים העיקרי למתודולוגיה זו הוא ליגאז. כאן משתמשים בשברי DNA עם תווית פלואורסצנטית, זה מקושר על ידי האנזים וזה מתגלה.

הבעיה הגדולה ביותר בטכניקה זו היא אורך השבר הקצר שהיא מסוגלת לעבד.

יון טורנט רצף

טכניקה זו מבוססת על מדידת יון H ⁺ שמשתחרר בכל פעם שמשולב נוקלאוטיד חדש. העיקרון די דומה לפירוזינג, אך זול בהרבה.

דוגמאות

רצף הגנום האנושי

רצף הגנום האנושי היה אחד האתגרים המבטיחים ביותר בביולוגיה, כמו גם היווה את אחת היריבות המוערכות ביותר בתולדות המדע. למעשה, עבור המדענים המעורבים בפרויקט, רצף הגנום הפך לתחרות.

בשנת 1990 החל את מה שכונה "פרויקט הגנום האנושי", בראשות המדען המפורסם, זוכה פרס נובל, ג'יימס ווטסון. אחרי שנה, בשנת 1991, ונטר לוקח על עצמו את האתגר "להכות" את ווטסון ורצף את הגנום שלפניו. עם זאת, בשנת 1992, ווטסון פרש והפיקוד נלקח על ידי חוקר אחר.

בשנת 1995 הודיע ​​ונטר על הצלחתו ברצף מוחלט של גנום חיידקי בשיטת הרצף האקראי. באופן דומה, הקבוצה היריבה הודיעה שנה לאחר מכן על רצף הגנום של השמרים.

בשנת 2000 הסתיים התואר. שתי החברות פרסמו את תוצאות הגנום השלמות המקדימות שלהן בשני כתבי העת היוקרתיים ביותר של המדע: טבע ומדע.

עם זאת, המדענים המשיכו לעבוד על שיפור ההצעות, ובשנת 2006 הושלמו רצפי הכרומוזומים האנושיים.

חשיבות ויישומים

הכרת סדר הנוקליאוטידים של מולקולה חשובה כמו DNA היא בעלת ערך לביולוגים ולאנשי מקצוע קשורים. שרשרת polynucleotides זו מכילה את כל המידע הדרוש לפיתוח ותחזוקה של כל צורות החיים.

מסיבות אלה, הידע ברצף זה חיוני למחקר ביולוגי. ביסודו, רצף מאפשר למדוד את אחד המאפיינים החשובים ביותר של מערכות ביולוגיות ולקבוע הבדלים ביניהם.

רצף נעשה בשימוש נרחב על ידי טקסונומים ומערכתיות, מכיוון שרצפי DNA מסוימים מאפשרים לקבוע קריטריונים כדי להסיק אם שני אורגניזמים שייכים לאותו מין או לא, בנוסף לכך שהם יכולים להציע השערות לגבי היחסים הפילוגנטיים ביניהם.

בנוסף, לרצף DNA יש יישומים ברפואה ואבחון. לדוגמא, ישנן מערכות זולות ונגישות אשר באמצעות רצף מאפשרות להעריך את הנטייה לפתח מחלות מסוימות (כמו סרטן) באמצעות מה שמכונה פולימורפיזם של נוקליאוטיד יחיד.

חקירות מהסוג הפלילי והפלילי הועשרו גם בטכניקות רצף, בהן ניתן להשתמש כראיה אמינה להשתתפותו של אדם מסוים בפשע.

הפניות

1. הת'ר, JM, & Chain, B. (2016). רצף הרצפים: ההיסטוריה של רצף ה- DNA. גנומיקה, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). מהפכת הרצף של הדור הבא והשפעתה על הגנומיקה. תא, 155 (1), 27-38.
3. לוי, ג '(2010). יריבויות מדעיות. מגלילאו לפרויקט הגנום האנושי. Paraninfo העריכה.
4. סנגר, פ., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). רצף DNA עם מעכבי סיום שרשרת. הליכי האקדמיה הלאומית למדעים, 74 (12), 5463-5467.
5. שוסטר, SC (2007). רצף הדור הבא הופך את הביולוגיה של ימינו. שיטות טבע, 5 (1), 16.
6. שו, ג '(עורכת). (2014). רצף הדור הבא. עיתונות אקדמית של קייסטר.