בדיקת אוקסידאז: רציונל, נוהל ושימושים - ביולוגיה - 2025

מבחן מונואמין הוא שיטה לאבחון המציג את הנוכחות של ג מונואמין ציטוכרום המורכב הנקרא האנזים. מערכת זו גורמת להתמרה של ציטוכרום המופחת לחמצון, מכיוון שהיא לוכדת חמצן וזה בתורו משמש כקולט האלקטרונים האחרון (H ⁺ ) בשרשרת הנשימה.

המונח אוקסידאז הוא דרך קצרה להתייחס לאנזים ציטוכרום אוקסידאז, המכונה גם אינדופנול אוקסידאז. בימי קדם האמינו כי האנזימים ציטוכרום אוקסידאז ואינדרופנול אוקסידאז היו שני אנזימים שונים, אך כיום ידוע שהם זהים.

מבחן אוקסידאז חיובי ושלילי. מקור: לא סופק מחבר קריא במכונה. Alpha.prim ~ commonswiki הניח (בהתבסס על טענות בזכויות יוצרים).

ציטוכרומים הם מצדם המופרוטאינים המכילים ברזל ומשלימים את מערכת הציטוכרום אוקסידאז. ציטוכרומים יכולים להשתנות ממין למין.

ישנם סוגים שונים של ציטוכרומים (ציטוכרומים a1, a2, a3 ו- 0). יש חיידקים שיכולים לייצר רק אחד, אך אחרים עד שניים או שלושה בכל פעם. במובן זה, נוכחותם של ציטוכרום a ו- a3 ידועה בשם ציטוכרום אוקסידאז c. זהו סוג הציטוכרום שבדיקת האוקסידז מזהה.

הסוגות Neisseria ו- Pseudomonas מכילות ציטוכרום אוקסידאז c. ז'אנרים אלה נותנים את מבחן האוקסידאז החיובי, ועוזרים להבדיל ביניהם בין הסוגים Acinetobacter ו- Stenotrophomonas בהתאמה.

ישנן גם סוגות אחרות שהן חיוביות לאוקסידז.

בָּסִיס

מאפייני מערכת cytochrome oxidase c

מערכת cytochrome oxidase c עובדת באופן הבא: מיקרואורגניזמים חיוביים לאוקסידאז משתמשים בחמצן כדי לייצר אנרגיה באמצעות הנשימה אירובית. מערכת זו פועלת בזכות הובלת אלקטרונים מחומרים תורמים כמו NADH ⁺ לחומרים קולטן, במקרה זה חמצן.

התוצאה היא ייצור אנרגיה (ATP) ומי חמצן מי חמצן, תלוי במערכת הציטוכרום אוקסידאז שיש למיקרואורגניזם.

זו הסיבה שרוב החיידקים האוקסידזיים הם גם חיוביים לקטליז, תנאי הכרחי למיגור מי החמצן המיוצר, מכיוון שחומר זה רעיל לחיידקים.

מערכת ציטוכרום אוקסידאז C קיימת בכמה חיידקים אירוביים, בחלקם אנאירובים פקולטטיביים, מעטים במיקרואירופיליים, ואינם אנאירובים קפדניים. זה האחרון מובן מאחר ואנאירובים קפדניים אינם יכולים לחיות בנוכחות חמצן, ולכן הם חסרים מערכת ציטוכרום אוקסידאז.

עקרון המבחן

בבדיקה זו הוא משתמש בחומרים המשמשים כמקבלי אלקטרונים מלאכותיים, ומחליפים חומרים טבעיים בתוך שרשרת הובלת האלקטרונים.

בעיקר משתמשים בצבעים כמו פרפנילנדימין ואינדיפנול, המשמשים כמצעי קולטן ותורמי אלקטרונים מלאכותיים.

Paraphenylenediamine מתחמצן על ידי מערכת cytochrome oxidase c. הצבע בצורתו המופחתת חסר צבע, אך בצורתו המחומצנת הוא צבעוני.

כך ניתן להבחין בנוכחות מערכת cytochrome oxidase c; מכיוון שתגובה חיובית תיצור צבע לבנדר או כחול-סגול בהתאם לתגובת השימוש.

מצד שני, אם החומר האחרון המקבל אלקטרונים בשרשרת הנשימה שונה מחמצן, מבחן האוקסידאז יהיה שלילי (אין ייצור צבע); זה המקרה עם מיקרואורגניזמים אנאירוביים.

באופן דומה, אם הציטוכרום שמשמש את המיקרואורגניזם שונה מ- cytochrome oxidase c, הוא גם יתן את המבחן השלילי.

תהליך

ישנם ריאגנטים ופרוטוקולים שונים לבדיקת האוקסידאז, כולם לאותה מטרה.

מגיבים

מגיב Kovacs, מגיב גורדון ומקלוד, מגיב נאדי, נגר, Carpenter, Suhrland ו- Morrison, ושימוש בדיסקי אוקסידאז.

מגיב ל- Kovacs אוקסידאז

זה מורכב מ- 1% טטרמתיל-p-פנילנדימין דיהידרוכלוריד.

המגיב של קובץ 'מוכן על ידי המסת 1 גרם מהחומר שהוזכר לעיל ב- 50 מ"ל מים מזוקקים. זה מחומם בעדינות עד להמסה מוחלטת. מעבירים לבקבוק ענבר בעל קיבולת מספקת וממלאים את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים. המתן לפחות 15 דקות לפני השימוש. לאחסן במקרר מוגן מפני אור.

זה מכונה מגיב Kovacs oxidase, כדי להבדיל אותו מגיב ה- Kovacs המשמש לחשיפת מבחן האינדול. מגיב זה הוא הרגיש ביותר, פחות רעיל אך יקר יותר משאר המגיבים.

ניתן להצביע על תגובה חיובית עם מגיב זה עם שינוי צבע המושבה ללבנדר, שהופך במהירות לסגול כמעט שחור. תגובה שלילית ניכרת מכיוון שאין שינוי צבע במושבה או שהיא מקבלת צבע ורדרד קל. המדיום יכול גם להחשיך, אבל זה לא אומר תגובה חיובית.

עם מגיב זה, זמן התגובה הוא קריטי, שינוי צבע המתרחש בין 5 ל -15 שניות נחשב כתגובה חיובית.

-ג'ורגון ומקלוד מגיב

זה מורכב דימתיל-p-פנילנדימין דיהידרוכלוריד, הידוע גם בשם N-dimethyl-p-פניylenediamine או p-aminodimethylaniline monohydrochloride. הוא מוכן כמתואר לנגיב Kovacs oxidase, ומחליף את החומר המעורב.

מגיב זה יציב מעט יותר מגיב Kovacs oxidase, אם כי כל המגיבים המכילים p-fenylenediamine אינם יציבים.

תגובה זו מאוחרת יותר, היא מתפרשת כחיובית עם הופעתו של צבע כחול-סגול תוך 10 עד 30 דקות.

-נדי מגיב

זה מורכב מ- 1% α-nththol באלכוהול אתילי (95% אתנול) ו- 1% aminodimethylaniline. את התערובת מכינים בחלקים שווים ומשתמשים באלכוהול אתילי מוחלט כדילול, עד שממלאים כמות מספקת ל 100 מ"ל.

-מגשר קרפנטר, סוהרלנד ומוריסון

זה מורכב מ- 1% p-aminodimethylalanine oxalate. הכן באותו אופן כפי שתואר עבור מגיב Kovacs oxidase, ומשתנה עבור החומר המתאים.

עם הפיתרון מוכן, מכינים רצועות בדיקה באופן הבא: 6-8 ס"מ. Whatman מס '1 רצועות נייר פילטר מספגות עם מגיב 1% דימתיל-p-פנילנדימין אוקסלט.

מותר להם להתייבש ללא מגע עם מתכת, לאחסן בצנצנות מכוסות בורג עם יבוש ולאחסן במקרר. רצועות אלה יציבות עד 6 חודשים.

זהו המגיב הכי יציב מבין כל אלה שהוזכרו ויכול להימשך עד 6 חודשים בתמיסה. נקודת פלוס נוספת היא שהיא לא מציירת את המדיום סביב המושבה, אם משתמשים בה ישירות על הצלחת.

המראה של צבע אדום מתפרש כמבחן חיובי.

-דיסקי אוקסידאז

מדובר בדיסקים מסחריים המוטבעים בחומר מגיב לבדיקת האוקסידאז. ישנם מספר מותגים מסחריים בשוק.

השימוש בו הוא פרקטי למדי, מכיוון שאין צורך להכין ריאגנטים טריים, דבר שמקל על העבודה. התוצאות שהתקבלו אמינות כל עוד הדיסקים נשמרים כראוי.

פרוטוקולים

שיטת צלחת ישירה, שיטה עקיפה על נייר ושימוש בדיסקים הספוגים בחומרים מגיבים לאוקסידאז.

שיטת לוח ישיר

2 או 3 טיפות מכל אחד מהריגנטים שהוזכרו לעיל מתווספים למטרה זו ישירות על המושבה (ים) הכלולים בצלחת של מדיום תרבות שאינו מכיל גלוקוז.

השינוי בצבע המושבות או לאו מתפרש, לא של המדיום. זמן התגובה התקף תלוי במגיב בו נעשה שימוש.

-שיטה ישירה על נייר

חותכים חתיכת נייר פילטר (Whatman מס '1) לגודל 6 ס"מ ² והניחו בתוך צלחת פטרי ריקה.

הוסף לנייר 2 או 3 טיפות של מגיב ה- Kovacs oxidase, קח חלק מהמושבה הנלמדת בעזרת ידית פלטינה או קיסם עץ ופיזר אותה בקו ישר על הנייר הספוג המגיב. פירוש תוך 5 עד 10 שניות.

עם הרצועות שהוכנו עם קרפנטר, סוהרלנד ומגיב מוריסון, מושבת מושבה על הרצועה היבשה. רצועה אחת משמשת לבדיקת מספר זנים. פירוש תוך 10 שניות.

-סקיות (ז

הרטיבו את הדיסקים המסחריים במים מזוקקים סטריליים לחלוטין והטילו עליהם את המושבה הנלמדת. מומלץ להשתמש בצלחות בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס, אם משתמשים בצלחות בטמפרטורת החדר או בצלחות בקירור התגובה מעט איטית יותר. פרש את שינוי הצבע בין 10 ל 20 שניות.

ניתן להשתמש במושבות הכלולות בדם או באגר שוקולד.

-דיסקים (שיטה עקיפה)

הרטיב את הדיסק כמתואר לעיל. הניחו אותו בצלחת פטרי ריקה. קח כמות מספקת של המושבה כדי ללמוד בעזרת ידית פלטינה או קיסם עץ והניחה על הדיסק. פרש את שינוי הצבע בין 10 ל 20 שניות.

להשתמש

הסוג Neisseria ו- Acinetobacter לעיתים דומים מאוד למורפולוגית מכיוון שלמרות שהסוג Acinetobacter הוא מוט שלילי גרם, הוא יכול לפעמים ללבוש צורה קוקואידית ולהפיץ אותם בזוגות, המדמה את הסוג Neisseria.

במקרה זה בדיקת האוקסידז באמת שימושית. סוג Neisseria הוא חיובי ו- Acinetobacter שלילי.

עם זאת, הסוג מורקסלה דומה מאוד לסוג ניסריה ושניהם נותנים תגובה חיובית; זו הסיבה שתמיד יש לבצע בדיקות תסיסה של פחמימות לצורך זיהוי מוחלט.

לעומת זאת, בדיקת האוקסידאז מועילה להבדיל בין חיידק השייך למשפחת Enterobacteriaceae (כולם שליליים אוקסידאז) מתסיסים אחרים, כמו הסוג Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (אוקסידאז חיובי).

הסוג ויבריו והליקובקטר הם גם חיוביים לאוקסידאז.

QA

השתמש בזנים ידועים של Escherichia coli כבקרה שלילית ובזנים של Pseudomonas aeruginosa כבקרה חיובית.

מגבלות

יש להשתמש בריגנטים המוכנים טריים, חיי המדף שלהם בתמיסה בטמפרטורת החדר הם קצרים מכיוון שהם מאוד לא יציבים. בקירור הם יכולים להימשך בין 5 ימים עד שבועיים.

-הראגנטים הם חסרי צבע, אם הם משנים צבע הם חייבים להיות מושלכים. דיסקים פגומים מופיעים בגלל שהם מחשיכים עם הזמן.

-תגובה חיובית עם מגיב ה- Kovacs oxidase בין 15-60 שניות נחשבת כתגובה מאוחרת ולאחר 60 שניות יש לראותה כשלילית.

-Hemophylus influenzae נותן תגובה אוקסידאז שלילית אם משתמשים בכל ריאגנטים עם דימתיל-p-פנילנדימין, אך חיוביים אם משתמשים במגיב Kovacs oxidase (tetramethyl-p-fenylenediamine).

-מדיום המכיל גלוקוז מפריע לבדיקה, ומביא לשלילת שווא.

זני שעלת בורדלה יכולים לתת תגובה חיובית שגויה אם הם מגיעים מלוחות אגר דם מרוכזות מאוד.

השימוש בידיות מתכת (ברזל) נותן תגובה חיובית שגויה.

המלצות

מכיוון שהריגנטים אינם יציבים מאוד ונוטים להתחמצנות עצמית, מומלץ להקפיא חלקים של 1 עד 2 מ"ל ולהסיר אותם לפי הצורך.

דרך נוספת לעכב את החמצון האוטומטי של המגיב היא להוסיף 0.1% חומצה אסקורבית בעת הכנת המגיבים.

מכיוון שהריגנטים אינם יציבים, מומלץ לבצע בקרת איכות שבועית.

אין להשתמש בחומרים מגיבים שאינם עוברים את מבחן בקרת האיכות.

הפניות

1. Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. מהדורה חמישית עריכה Panamericana SA ארגנטינה.
2. פורבס B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). אבחון מיקרוביולוגי של ביילי וסקוט. 12 ed. עריכה Panamericana SA ארגנטינה.
3. "מבחן אוקסידאז." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 15 ינואר 2018, 10:32 UTC. 3 אפריל 2019, 14:03
4. ארגון הבריאות העולמי. מדריך מעבדה לזיהוי ובדיקת רגישות לחיידקים מיקרוביאלים של פתוגנים חיידקיים בעלי חשיבותם של בריאות הציבור בעולם המתפתח. 2004. זמין בכתובת: who.int/drugresistance/infosharing
5. פסי ריאגנטים לאבחון פעילות האוקסידאז בחיידקים. הכומר קובנה מד טרופ. 2000; 52 (2): 150-151.