- בָּסִיס
- נוהל
- -הכנה
- מהדגימות
- מהלהבים
- קיבוע דגימות
- פריביליזציה
- חוסם
- טיפול בחיסון או חיסון
- הרכבה ותצפית
- סוגים
- חיסון פלואורסצנטי ישיר או ראשוני
- חיסון פלואורסצנטי עקיף או משני
- יישומים
- הפניות
Immunofluorescence הנה טכניקה immunostaining באמצעות נוגדנים מלוכדים קוולנטית מולקולות פלורסנט לזהות מטרות ספציפיות דגימות תאים המקובעים תמיכה מוצקה.
טכניקה זו כוללת התבוננות מיקרוסקופית עם ספציפיות אימונולוגית, ומאפשרת לצפות בתאים חיים או מתים שיכולים להציג כמויות זעירות של אנטיגנים. הוא נמצא בשימוש נרחב הן בתחום המחקר והן באבחון קליני של פתולוגיות שונות.
תיוג חיסוני של חוטי אקטין בתאי קרדיומיוציטים (מקור: Ps1415 דרך ויקימדיה Commons)
טכניקה זו, בעיקר איכותית (עם כמה וריאנטים כמותיים), קשורה באופן ספציפי להמחשת הדגימה על ידי אות המוצר של פלואורופור, שהיא מולקולה פלואורסצנטית הקשורה לנוגדן ואשר מסוגלת להתלהב באורך גל מסוים. .
בהקשר הסלולרי מאוד שימושי ללמוד נוכחות / היעדרות ומיקום תת-תאי של חלבונים. הטכניקה שימשה בתחילה במסגרת הקלינית לאבחון נגיפים כמו שפעת ובהמשך למחלות זיהומיות רבות אחרות.
זוהי טכניקה רגישה מאוד, ועם ציוד המיקרוסקופיה המתאים, היא יכולה לקבל רזולוציה טובה מאוד. זה דורש, לצורך התבוננותו, שימוש במיקרוסקופים קונפוקליים או אפלואורורציוניים.
עם זאת, למרות היותו פופולרי מאוד, הוא יכול להציג כמה בעיות חשובות ביחס להשגת פלואורסצנט לא ספציפי המייצר "רעש" רקע, מה שמגביל לעיתים קרובות את הקריאה הראויה של התוצאות.
בָּסִיס
אי-פלואורסצנציה מבוססת על ניצול התופעה הביולוגית של תגובת האינטראקציה בין נוגדן לאנטיגן. זה קשור באופן ספציפי להמחשה או איתור של תגובה זו על ידי מולקולות פלורסנט מרגשות לאורך גל ספציפי.
נוגדן הוא חלבון אימונוגלובולין המופרש מתאי B פעילים, הנוצר באופן ספציפי כנגד אנטיגן, אליו הוא יכול להיקשר עם זיקה גבוהה וספציפיות. אימפואורורנסנס עושה שימוש באימונוגלובולינים מסוג IgG, שנמצאים מסיסים בסרום הדם.
נוגדנים הם מולקולות של עד 950 kDa המורכבות משתי שרשראות פפטיד קצרות (קלות) ושתי "Y" צורות (כבדות) ארוכות. השרשראות הקלות והכבדות הן מחולקות לשני תחומים: משתנה אחד, המסוגל לזהות את האנטיגן, והשני קבוע או שמור, האופייני לכל מין.
אנטיגנים מוגדרים באופן פונקציונאלי כמולקולות הניתנות לזיהוי על ידי נוגדן והם לרוב חלבונים. כאשר חיה נחשפת לאנטיגן, הלימפוציטים של מערכת החיסון מופעלים, ומייצרים כנגד נוגדנים ספציפיים ושהם מתפקדים כמערכת הגנה.
לאנטיגן, כמו חלבון, למשל, יכול להיות יותר מאפיטופ או אתר זיהוי על ידי נוגדן, ולכן בסרום של החיה שנחשפת לאנטיגן עשויים להיות נוגדנים פוליקלוניים כנגד אזורים שונים של אותו חלבון.
אם כן, חיסון פלואורסצנטי מנצל את יכולתו של בעל חיים לייצר נוגדנים פוליקלוניים כנגד אנטיגן ספציפי על מנת לטהר אותו ובהמשך להשתמש בו לגילוי אותו אנטיגן בהקשרים אחרים.
בין הצבעים או המולקולות הפלואורסצנטיות המשמשות ביותר לטכניקות פלואורסצנטיות מסוימות של חיסון, ניתן למנות איזו-איזוציונאט פלואורסציין (FITC), טטרמתיל-רודודמין-איזותיוציאנאט-5 ו -6 (TRITC), ציאנינים רבים כמו Cy2, Cy3, Cy5 ו- Cy7 וצבעים הנקראים Alexa Fluor® , כמו Alexa Fluor®448.
נוהל
פרוטוקול החיסון הקרינה משתנה בהתאם לגורמים רבים, אולם מבחינה כללית הוא מקיף רצף לינארי של צעדים המורכבים מ:
- הכנת הלוחות והתאים
- קיבוע דגימות
- פריביליזציה
- חוסם
- טיפול בחיסון או חיסון
- הרכבה ותצפית
-הכנה
מהדגימות
הכנת הדגימות תהיה תלויה באופיין ובסוג הניסיון שיש לבצע. המקרה הפשוט ביותר, הכרוך בשימוש בתאים בהשעיה, יוסבר להלן.
ראשית יש להפריד תאים בהשעיה, כלומר במדיום תרבות נוזלי על ידי צנטריפוגה ואז לשטוף אותם בתמיסת חיץ או "חיץ" איזוסמוטי, השומר על שלמותם.
בדרך כלל משתמשים במאגר מלוחים פוספטים המכונה PBS, בו התאים מוחזרים מחדש ותערובת זו עוברת שוב צנטריפוגות בכדי להשיג את התאים ללא מדיום התרבות, העלולים להכיל חומרים מפריעים.
מהלהבים
יש להכין בזהירות את השקופיות המשמשות לתצפית מיקרוסקופית, בהן יתוקנו התאים לאחר מכן לטיפולים במורד הזרם המקביל.
אלה מכוסים או "רגישים" בתמיסה של פולי ליזין, פולימר סינתטי אשר ישמש כ"דבק מולקולרי "בין התאים לתומך המוצק, בזכות האינטראקציה האלקטרוסטטית בין המטענים החיוביים של קבוצות האמינו שלהם לבין מטענים שליליים על החלבונים המציפים תאים.
קיבוע דגימות
תהליך זה מורכב משילוב החלבונים שנמצאים בתוך התא על מנת לשמור על מיקומם המרחבי על כנו. המולקולות המשמשות חייבות להיות מסוגלות לחצות את כל סוגי ממברנות התא וליצור סריג עם החלבונים הקוואלנטיים.
פורמלדהיד ופאראפורמלדהיד, גלוטרלדהיד ואפילו מתנול נמצאים בשימוש נרחב, איתם מודגרים דגימות תאים למשך זמן מסוים ואז נשטפים בתמיסת חיץ איזוסמוטית.
לאחר תיקון התאים הם ממשיכים להיות מחוברים לסדינים שהרגישו בעבר עם פולי ליזין.
פריביליזציה
תלוי בסוג הבדיקה המתבצעת, יהיה צורך לחדור את התאים הנבדקים או לא. אם מה שמבקש זה לדעת את מיקום, נוכחותו או היעדרו של חלבון מסוים על פני התא, לא יהיה צורך בחדירה.
מצד שני, אם ברצונך לדעת את מיקומו של חלבון בתא, החדירה היא חיונית והיא תורכב מדגירת הדגימות באמצעות Triton X-100, חומר ניקוי המסוגל לחדור קרומי תאים.
חוסם
שלב מהותי בכל הטכניקות החיסוניות הוא חסימת. בשלב זה של התהליך, החסימה מורכבת מכיסוי, על הסדינים הרגישים, על כל האתרים עם מולקולות פולי ליזין אליהם התאים לא דבקו. כלומר, זה מונע כל איחוד לא ספציפי.
בדרך כלל פתרונות עם אלבומין בסרום בקר (BSA) במאגר PBS משמשים לחסימה והתוצאות הטובות ביותר מתקבלות ככל שזמן הדגירה עם פתרון זה ארוך יותר. לאחר כל שלב, כולל חסימה, יש לשטוף את הפיתרון שנותר.
טיפול בחיסון או חיסון
ההליך של החיסון או החיסון החיסון יהיה תלוי בעיקר אם מדובר בחיסון פלואורסצנטי ישיר או עקיף (ראה להלן).
אם מדובר בחיסון פלואורסצנטי ראשוני או ישיר, הדגימות יודגרו עם הנוגדנים הרצויים, אותם יש לחבר לצבעי הניאון. הליך הדגירה מורכב מהכנת הדילול של הנוגדן בתמיסה שתכיל גם BSA אך בשיעור נמוך יותר.
כאשר המקרה הוא של חיסון פלואורסצנטי משני או עקיף, יש לבצע שתי דגירות רצופות. תחילה עם הנוגדנים הרצויים ואחר כך עם הנוגדנים המסוגלים לאתר את האזורים הקבועים של האימונוגלובולינים הראשוניים. הנוגדנים המשניים הללו הם שקשורים קוולנטית לפלואורופורים.
הטכניקה מגוונת מאוד, ומאפשרת סימון בו-זמני של יותר מאנטיגן אחד לכל דגימה, כל עוד יש נוגדנים ראשוניים המקושרים לפלואורופורים שונים, במקרה של אימונפלואורורציה ישירה.
לצורך תיוג סימולטני בחיסון פלואורסצנטי עקיף, יש לוודא כי כל נוגדן ראשוני מיוצר בבעלי חיים שונה וכן כל נוגדן משני משודך לפלואורופור אחר.
בדומה לחסימה, דגירה עם נוגדנים נותנת תוצאות טובות יותר ככל שזמן זה ארוך יותר. לאחר כל שלב יש לשטוף את עודפי הנוגדנים שלא נקשרו לדגימות ובחיסון חיסוני משני יש לחסום לפני הוספת הנוגדן המשני.
בטכניקות מסוימות משתמשים בכתמים אחרים שאינם קשורים לריכוך חיסוני, כמו מכתים של DNA גרעיני עם הפלואורפור DAPI.
הרכבה ותצפית
במהלך הדגירה הסופית עם הפלואורופורים יש צורך שהדגימות יישארו בחושך. לתצפית תחת המיקרוסקופ, מקובל להשתמש בכמה חומרים בכדי לשמר את הקרינה של הפלואורופורים המקושרים לנוגדנים.
סוגים
סיכום גרפי של איפור-פלואורסצנציה ישירה ועקיפה (מקור: Westhayl618 דרך Wikimedia Commons)
חיסון פלואורסצנטי ישיר או ראשוני
זה קשור לגילוי אנטיגנים באמצעות נוגדנים ניאון. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו הוא מהירותה, עם זאת, מקרים רבים של כריכה לא ספציפית יכולים להתרחש בתהליך, במיוחד כאשר בוחנים סרומה אנושית, מכיוון שהם עשירים בנוגדנים הטרוגניים מאוד.
חיסון פלואורסצנטי עקיף או משני
זה ידוע גם כטכניקת ה"כריך "וזה כרוך בפיתוח הטכניקה בשני שלבים. הראשון קשור לשימוש בנוגדן שאינו פלורסנט וקשירתו לאנטיגן המעניין.
כנגד האזור הקבוע של הנוגדן הראשון הזה (שישמש כעת כנוגדן), נעשה שימוש בנוגדן שני המסוגל לזהות אותו, הקשור למולקולת ניאון.
הופעתו של אות פלורסנט תהיה תוצאה של הכרה ספציפית בין הנוגדן הראשון שאינו פלורסנט לבין האנטיגן המעניין; הנוכחות של נוגדן ראשון זה מציבה את זו של השנייה, המתויגת ובזכותה ניתן לקבוע את נוכחותו של נוגדן או היעדרו.
למרות היותה טכניקה הרבה יותר זמן מאשר חיסון פלואורסצנטי ישיר (מכיוון שהיא כוללת שלב נוסף של דגירה), טכניקה זו אינה כוללת תכנון של נוגדן פלואורסצנטי לכל אנטיגן שנחקר, מה שמביא, במונחים כלכליים, קיימא יותר.
יתר על כן, זוהי טכניקה רגישה יותר מבחינת הגברת האות, מכיוון שיותר מנוגדן משני אחד יכול להיקשר לאזור הקבוע של הנוגדן הראשוני, ובכך להגביר את עוצמת האות הניאון.
יישומים
כפי שצוין בעבר, אימונופורורצנציה היא טכניקה מגוונת ביותר, אשר שימשה במובנים רבים בתחומים המדעיים והקליניים. ניתן להשתמש בו כדי לענות על שאלות אקולוגיות, גנטיות ופיזיולוגיות הנוגעות לאורגניזמים רבים.
בין היישומים הקליניים, הוא משמש לאבחון ישיר של כמה מחלות דרמטולוגיות, בין אם באמצעות אימונפלואורורנציה ישירה או עקיפה על רקמת האפיתל של החולים שנבדקו.
קיימות טכניקות אי-פלואורסצנטיות באורגניזמים חד-תאיים כמו שמרים כדי להמחיש מיקרו-צינורות אינטרא-גרעיניים וציטופלזמה, אקטין וחלבונים נלווים, חוטים 10 ננומטר, ומרכיבים אחרים של ציטופלזמה, קרום ודפנות התא.
הפניות
- פרוטוקול אבקמה, אימונוציטוכימיה ופרוטוקול חיסון. נשלח מ- abcam.com
- גרף, סי (2012). צבעי פלורסנט. נשלח מ- leica-microsystems.com
- מילר, ד.מ., ושקסט, די.סי. (1995). מיקרוסקופיה של איבר-פלואורסצנציה. בשיטות בביולוגיה של התא (כרך 48, עמ '365–394). עיתונות אקדמית בע"מ
- Odell, ID, and Cook, D. (2013). טכניקות חיסון פלואורסצנטי. Journal of Dermatology Investigative, 133, 1–4.
- פרינסל, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, and Brian, K. (1991). שיטות אימונות פלואורסצנטיות לשמרים. בשיטות אנזימולוגיה (כרך 194, עמ '565–602). עיתונות אקדמית בע"מ
- Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). יישומים של איפור-פלואורסצנטי בוירולוגיה של בריאות הציבור. ביקורות בקטריולוגיות, 28 (4), 402–408.
- Vrieling, EG, Anderson, DM (1996). אי-פלואורסצנציה במחקר פיטופלנקטון: יישומים ופוטנציאל. J: Pholol. , 32, 1–16.