דאפי (4 ', 6-דימידינו-2-פנילינדול): מאפיינים, רציונל, שימוש - כִּימִיָה - 2025

ה- DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) הוא צבע על ידי תכונה פלואורסצנטית משמש כסמן, הנמצא בשימוש נרחב בתחום מיקרוסקופיית הקרינה או ציטומטריה זרימה, בין היתר. הקרינה שהיא פולטת היא כחול בהיר, העירור שלה מתרחש בין 455-461 ננומטר (אור UV).

צבע DAPI יכול לעבור בממברנה התאית של תאים מתים בקלות רבה. זה יכול גם להכתים את גרעיני התאים החיים, אך במקרה זה, הריכוז של זה חייב להיות גבוה יותר.

מבנה כימי של צבע ניאון DAPI. מקור: תמונה: קובץ: DAPI.svg הוא גרסת וקטור של קובץ זה. יש להשתמש בה במקום תמונת רסטר זו כאשר אינה נחותה / ריצ'רד ווילר (זפיריס) תמונה ערוכה

הצבע מסוגל לגשת ל- DNA סלולרי שעבורו יש זיקה מיוחדת, נקשר באומץ רב לבסיסים החנקניים אדנין ותמין. מסיבה זו היא שימושית מאוד בכמה טכניקות ביולוגיה מולקולרית.

תרכובת זו שייכת לקבוצת הצבעים האינוליים והוכחה כבעלי רגישות גבוהה יותר ל- DNA מאשר אתידיום ברומיד ופרודידיום יוד, במיוחד על ג'לי agarose.

השימוש בצבע פלואורסצנטי זה הוא רחב מאוד, מכיוון שהוא מועיל ל: בחינת שינויים ב- DNA בתהליכים אפופטוטיים (מוות תאים) ולכן גילוי תאים בתהליך זה; לתמונת טביעת רגל של DNA (הדפסת צילומי DNA); ללמוד זיהום חיידקי; או לדמיין פילוח גרעיני.

זה שימש גם במחקר של להקות כרומוזומליות, לגילוי ה- DNA של Mycoplasmas sp, באינטראקציה עם DNA-חלבון, במכתים וספירת תאים על ידי אימונפלואורורנס ואפילו לצביעת גרגרי אבקה בוגרים.

מאפיינים

DAPI הוא קיצור שמו הכימי (4 ', 6-diamidino-2-פניylindole). הנוסחה המולקולרית שלה היא C ₁₆ H ₁₅ N _5. יש לה משקל מולקולרי של 350.3. בסמוך לטווח אור ה- UV (345 עד 358 ננומטר) מתרחשת העירור המרבי של מתחם ה- DAPI-DNA ואילו פליטת הקרינה המרבית מתרחשת בין 455-461 ננומטר.

צבע זה מאופיין כאבקה צהובה, אך המבנים המסומנים בפלואורופור זה פולטים אור כחול מבריק.

זהו תרכובת המסיסה במים, עם זאת, כדי להאיץ את פירוקה, ניתן ליישם מעט חום. ניתן לדלל אותו עם PBS אך לא להמיס אותו ישירות.

לאחר הכנת הצבע, יש לאחסן אותו בחושך, כלומר מוגן מפני אור, בטמפרטורה של 2 עד 8 מעלות צלזיוס (מקרר). בתנאים אלה, הצבע יציב יותר משלושה שבועות או חודשים.

אם הוא מוגן מפני אור אך נותר בטמפרטורת החדר יציבותו יורדת לשבועיים או שלושה, אך חשופה לאור ישיר ההידרדרות היא מהירה מאוד. אם ברצונך לאחסן הרבה יותר זמן, ניתן להקפיא אותו בקירור -20 מעלות צלזיוס המופץ ביחידות.

בָּסִיס

מכתים זה מבוסס על יצירת משטח גרעיני בטכניקות הביולוגיה המולקולריות העיקריות, כגון: ציטומטריה זרימה, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומכתים של כרומוזומים מטאפזיים או גרעינים בין-פאזיים, בין היתר.

טכניקה זו מבוססת על הזיקה הרבה שיש לצבוע לבסיסים החנקניים (אדנין ותימין) הכלולים בחומר הגנטי (DNA) בחריץ הקטין. בעוד שברמת הציטופלזמה הוא משאיר מעט מאוד רקע.

כאשר הצבע הפלואורסנטי נקשר לאזורי האדנין והתימין של ה- DNA, הקרינה עולה באופן משמעותי (פי 20 יותר). הצבע שהוא פולט הוא כחול בהיר. יש לציין כי אין פליטת פלואורסצנציה כאשר נקשרת לזוגות בסיס GC (גואנין-ציטוזין).

חשוב לציין שלמרות שיש לזה גם זיקה ל- RNA, זה לא גורם לבעיה, מכיוון שהדרגה הגבוהה ביותר של פליטת אנרגיה ממולקולה זו מתרחשת באורך גל אחר (500 ננומטר), בניגוד ל- DNA, שעושה זאת במהירות 460 ננומטר. יתרה מזאת, העלייה בפלואורסצנציה לאחר הקשור ל- RNA היא 20% בלבד.

DAPI משמש יותר לכתמת תאים מתים (קבועים) מאשר תאים חיים, מכיוון שנדרש ריכוז גבוה בהרבה של הצבע כדי להכתים את האחרון, הסיבה לכך היא שממברנה התא הרבה פחות חדירה ל- DAPI כאשר היא חיה.

ניתן להשתמש בצבע DAPI בשילוב פלואורופורים אדומים וירוקים לחוויה רב צבעונית.

להשתמש

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) הוא פלואורופור מצוין ולכן הוא נעשה שימוש נרחב בטכניקות שונות ולמטרות שונות. להלן הסבר השימוש ב- DAPI בטכניקות העיקריות.

ציטומטריה זרימה

החוקרים Gohde, Schumann ו- Zante בשנת 1978 היו הראשונים שהשתמשו והציעו DAPI כפלואורופור בטכניקת הציטומטריה של הזרימה, וזכו להצלחה רבה בזכות הרגישות הגבוהה שלה ל- DNA והעוצמה הגבוהה שלה בפליטת הקרינה.

השימוש ב- DAPI בטכניקה זו מאפשר ללמוד את מחזור התא, כימות התאים והכתמת תאים חיים ומתים.

למרות שישנם צבעי צבע אחרים, כמו אתידיום ברומיד, תחמוצת Hoechst, כתום אקרידין ופרודידיום יוד, DAPI הוא אחד הנפוצים ביותר שכן הוא ניתן לצילום יותר מאלה שהוזכרו קודם.

לטכניקה זו נדרש לתקן את התאים, לשם כך ניתן להשתמש באתנול מוחלט או 4% paraformaldehyde. הדגימה ממוקמת בצנטריפוגה והסופר-נפט מושלך, לאחר מכן התאים מתייבשים על ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ PBS למשך 15 דקות.

עם חלוף הזמן, הכינו את הכתם DAPI עם חיץ מכתים (FOXP3 מבית BioLegend) בריכוז של 3 מיקרומטר.

צנטר את הדגימה, השליך את הסופר-נפט, ואז כסה עם 1 מ"ל של תמיסת DAPI למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

קח את הדגימה לציטומטר הזרימה בעזרת הלייזר המתאים.

זרימת מיקרו-פלואורומטריה

טכניקה נוספת בה משתמשים ב- DAPI היא במיקרו-פלואורומטריה בזרימה יחד עם פלואורופור אחר הנקרא מיטרמיצין. שתיהן שימושיות לכימות DNA של כלורופלסט בנפרד, אך DAPI מתאים ביותר למדידת חלקיקי בקטריופאג T4.

הַכלָאָה

טכניקה זו משתמשת בעיקר בבדיקות DNA המסומנות בצבע ניאון שיכול להיות DAPI.

הדגימה דורשת טיפול בחום בכדי לדלל את ה- DNA הכפול גדילי ולהמיר אותו לשני גדילי חד-חוטים. לאחר מכן הוא מוקרב עם בדיקת DNA המפולטת בתווית DAPI בעלת רצף עניין.

מאוחר יותר הוא נשטף בכדי לחסל את מה שלא הוקבר, כל הניגוד משמש לדימוי של ה- DNA. מיקרוסקופ הפלואורסצנציה מאפשר התבוננות בבדיקה של הניתוח הכלאיים.

לטכניקה זו מטרת גילוי רצפים ספציפיים ב- DNA כרומוזומלי, היכולת לאבחן מחלות מסוימות.

טכניקות ציטו-מולקולריות אלה עזרו רבות בקביעת פרטים במחקר הקריוטיפים. לדוגמה, הוא הראה את אזורי הבסיס העשירים בזוגות של אדנוזין ותימין הנקראים אזורים הטרוכרומטיים או להקות DAPI.

טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר הכרומוזומים והכרומטין בצמחים ובעלי חיים, כמו גם לאבחון פתולוגיות טרום לידתי והמטולוגיות אצל בני אדם.

בטכניקה זו ריכוז ה- DAPI המומלץ הוא 150 ng / ml למשך 15 דקות.

יש לאחסן מגלשות מורכבות מוגנות מפני אור בטמפרטורות של 2-8 מעלות צלזיוס.

מכתים חיסוניים נגד פלואורסצנטיות

התאים קבועים עם 4% paraformaldehyde. אם יש להשתמש בכתמים אחרים, DAPI נותר בסוף כמתקן דלפק והתאים מכוסים בתמיסת PBS למשך 15 דקות. עם חלוף הזמן, הכינו את פתרון DAPI על ידי דילול עם PBS, כך שהריכוז הסופי הוא 300 מיקרומטר.

לאחר מכן מוסרים עודפי ה- PBS ומכוסים ב- DAPI למשך 5 דקות. שוטף מספר פעמים. השקופית נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחת למסנן המתאים.

גיליון בטיחות

יש לטפל בתרכובת זו בזהירות, מכיוון שמדובר בתרכובת שיש לה תכונות מוטגניות. הפחמן המופעל משמש למיגור תרכובת זו מתמיסות מימיות שיש להשליך.

יש להשתמש בכפפות, חלוק ומשקפי בטיחות כדי למנוע תאונות עם מגיב זה. אם מתרחש מגע עם עור או רירית, יש לשטוף את האזור במים מספיק.

אסור לך לפטף מגיב זה דרך הפה, להשתמש בטפטפות.

אין לזהם את המגיב עם חומרים חיידקים שכן הדבר יוביל לתוצאות שגויות.

אין לדלל את כתם DAPI יותר מהמומלץ, מכיוון שהוא יפחית משמעותית את איכות הכתם.

אין לחשוף את המגיב לאור ישיר, או לשמור על חום כיוון שהוא מפחית את הקרינה.

הפניות

1. Brammer S, Toniazzo C ו- Poersch L. Corantes המעורבים בדרך כלל בציטוגנטיקה צמחית. מכון ארק. ביול. 2015, 82. זמין מ: scielo.
2. מעבדות זעזוע. DAPI. ניתן להשיג ב: menarinidiagnostics.com/
3. מעבדות ציטוצל. 2019. הוראות לשימוש ב- DAPI. זמין באתר cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. מושגים וטכניקות באקולוגיית נחלים. (2009). רובס עריכה, ספרד. ניתן להשיג ב: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, נטלי A, Neves C, Maldonado I. שימוש בפלואורסצנציה בשיטת דיסקטור שונה כדי להעריך את מספר המיוציטים ברקמת הלב. קשת בראס. קרדיול. 2012; 98 (3): 252-258. זמין מ-: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. נוכחות פיטופלסמות בפפאיה (קאריקה פפאיה) במקסיקו. מגזין צ'אפינגו. סדרת גננות, 2011; 17 (1), 47-50. ניתן להשיג ב: scielo.org.