כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC): רציונל, ציוד, סוגים - כִּימִיָה - 2025

כרומטוגרפיה הנוזלית הביצועים הגבוהים היא טכניקה אינסטרומנטלי המשמשת בניתוחים כימיים אשר תערובות נפרדות מותרות, לטהר לכמת מרכיביו, ומחקרים נוספים. זה ידוע בקיצור HPLC, שמקורו באנגלית: כרומטוגרפיה נוזלית גבוהה.

כך, כשמו כן הוא, הוא פועל באמצעות מניפולציה של נוזלים. אלה מורכבים מתערובת המורכבת מהאנליט או המדגם המעניין, וממיסים אחד או יותר המשמשים כשלב הנייד; כלומר זה שגורר את האנליט דרך כל ציוד ה- HPLC והעמודה.

ציוד HPLC. מקור: Dqwyy

HPLC נמצא בשימוש נרחב על ידי מעבדות ניתוח איכות בחברות רבות; כמו תרופות ומזון. על המטפל המדובר להכין את הדגימה, את השלב הנייד, לבדוק את הטמפרטורה ופרמטרים אחרים, ולהניח את הבקבוקונים בתוך הגלגל או הקרוסלה כדי שהציוד יבצע את הזריקות באופן אוטומטי.

ציוד ה- HPLC מחובר למחשב דרכו ניתן לצפות בכרומטוגרמות הנוצרות, כמו גם להתחיל את הניתוחים, לשלוט על קצב הזרימה של השלב הנייד, לתכנת את סוג ההתרחשות (איזוקרטי או שיפוע) ולהדליק את הגלאים (UV -זה או ספקטרופוטומטר המוני).

בָּסִיס

בשונה מכרומטוגרפיה נוזלית קונבנציונלית כמו נייר או כרומטוגרפיה עמודה של סיליקה ג'ל, HPLC אינו תלוי בכוח המשיכה של הנוזל להרטיב את השלב הנייח. במקום זאת, זה עובד עם משאבות בלחץ גבוה, שמשקיעות את השלב הנייד או חומרי ניקוז דרך העמוד בעוצמה גבוהה יותר.

בדרך זו, אין הכרח לשפוך את השלב הנייד מדי פעם דרך העמודה, אלא המערכת עושה זאת ברציפות ועם קצב זרימה גבוה יותר.

אבל היעילות של טכניקה זו אינה נובעת אך ורק מפרט זה, אלא גם בחלקיקי המילוי הזעירים המרכיבים את השלב הנייח. בהיותו קטן יותר, אזור המגע שלו עם השלב הנייד גדול יותר, כך שהוא יתקשר טוב יותר עם האנליט והמולקולות שלו ייפרדו יותר.

שני המאפיינים הללו, בתוספת העובדה שהטכניקה מאפשרת צימוד של גלאים, הופכים את HPLC עדיפה בהרבה על כרומטוגרפיה של שכבה דקה או נייר. ההפרדות יעילות יותר, השלב הנייד עובר טוב יותר בשלב הנייח וכרומטוגרמות יכולות לאתר כל כשל בניתוח.

צִיוּד

תרשים מפושט של פעולת ציוד HPLC. מקור: גבריאל בוליבר.

למעלה תרשים מפושט כיצד עובד ציוד HPLC. הממסים נמצאים במכלים שלהם בהתאמה, מסודרים עם צינורות כך שהמשאבה מכניסה נפח קטן מהם לציוד; לפיכך יש לנו את השלב הנייד.

ראשית יש להתפוגג מהשלב הנייד או האלולנט, כך שהבועות לא ישפיעו על הפרדת מולקולות האנליט, שמתערבבות עם השלב הנייד ברגע שהציוד ביצע את הזריקות.

העמוד הכרומטוגרפי ממוקם בתוך תנור שמאפשר לווסת את הטמפרטורה. לפיכך, עבור דגימות שונות קיימות טמפרטורות נאותות להשגת הפרדות ביצועים גבוהים, כמו גם קטלוג רחב של עמודות וסוגי מילויים או שלבים נייחים לניתוח ספציפי.

השלב הנייד עם האנליט המומס נכנס לטור, ומתוכו המולקולות ש"רגישות "פחות זיקה לשלב הנייח, מתחלקות תחילה, ואילו אלה שנשמרים יותר על ידן נעות מאוחר יותר. כל מולקולה מחוללת מייצרת אות המוצג על הכרומטוגרמה, שם נצפים זמני האצירה של המולקולות המופרדות.

ומצד שני, השלב הנייד לאחר שעבר בגלאי מסתיים במיכל פסולת.

סוגי HPLC

ישנם סוגים רבים של HPLC, אך מבין כולם המצטיינים ביותר הם ארבעת הבאים.

כרומטוגרפיה שלב רגיל

כרומטוגרפיה שלב רגיל מתייחסת למצב בו השלב הנייח הוא קוטבי באופיו, בעוד שהשלב הנייד אינו פולני. למרות שזה נקרא נורמלי, למעשה הוא הכי פחות בשימוש, כאשר השלב ההפוך הוא הנפוץ והיעיל ביותר.

כרומטוגרפיה שלב הפוך

בהיותו שלב הפוך, כעת השלב הנייח הוא אפולארי והקצב שלב נייד. זה שימושי במיוחד בניתוח ביוכימי, מכיוון שביו-מולקולות רבות מתמוססות טוב יותר במים ובממסים קוטביים.

כרומטוגרפיה של חילופי יונים

בסוג זה של כרומטוגרפיה, האנליט, עם מטען חיובי או שלילי, עובר בעמודה ומחליף את היונים שהוא מאכלס. ככל שהמטען גבוה יותר, כך השמירה שלו גבוהה יותר, וזו הסיבה שהוא משמש באופן נרחב להפרדת קומפלקסים יוניים של מתכות מעבר.

כרומטוגרפיה הדרת גודל

כרומטוגרפיה זו, ולא הפרדה, אחראית על טיהור התערובת המתקבלת. כשמו כן הוא, האנליט אינו מופרד יותר תלוי עד כמה הוא קשור קרוב לשלב הנייח, אלא לפי גודלו והמיסו המולקולרי.

מולקולות קטנות יותר יישמרו יותר ממולקולות גדולות, מכיוון שהאחרון לא נלכד בין נקבוביות מילוי העמודים הפולימריות.

יישומים

HPLC מאפשר ניתוח איכותי וגם כמותי. בצד האיכותי, על ידי השוואה בין זמני האצירה של הכרומטוגרמה בתנאים מסוימים, ניתן לאתר נוכחות של תרכובת מסוימת. נוכחות כזו עשויה להעיד על מחלות, ניאוף או שימוש בסמים.

לכן זהו חלק ממחשבים ממעבדות אבחון. כמו כן, הוא מצוי בתעשיות התרופות, מכיוון שהוא מאפשר לאמת את טוהר המוצר, כמו גם את איכותו ביחס לפירוקו בסביבת הקיבה. חומרי התחלה כפופים גם ל- HPLC כדי לטהר אותם ולהבטיח ביצועים טובים יותר בסינתזת התרופות.

HPLC מאפשר ניתוח והפרדה של תערובות מורכבות של חלבונים, חומצות אמינו, פחמימות, ליפידים, פורפירינים, טרפנואידים, והוא למעשה אפשרות מצוינת לעבודה עם תמציות צמחים.

ולבסוף, כרומטוגרפיה של הרחקה מולקולרית מאפשרת לך לבחור פולימרים בגדלים שונים, מכיוון שחלקם עשויים להיות קטנים יותר או גדולים מאחרים. בדרך זו מתקבלים מוצרים בעלי מסה מולקולרית נמוכה או גבוהה ממוצעת, וזה גורם מכריע לתכונותיהם ויישומיהם או הסינתזה העתידית.

הפניות

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). כימיה אנליטית כמותית. (מהדורה חמישית). פרסון הול פרנסיס.
2. בוסי חואן. (2007). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. . התאושש מ: fing.edu.uy
3. ויקיפדיה. (2019). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. התאושש מ: en.wikipedia.org
4. קלארק ג'ים. (2007). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. התאושש מ: chemguide.co.uk
5. מתיו ברקוביץ '. (05 בדצמבר, 2019). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. כימיה LibreTexts. התאושש מ: chem.libretexts.org
6. רופא המשפחה תומאס. (15 באפריל 2013). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) - שיטות, יתרונות ויישומים. התאושש מ: azom.com