אגר MÜELLER HINTON: בסיס, הכנה ושימושים - ביולוגיה - 2025

מולר הינטון אגר היא לא סלקטיבית, מזין בינוני מוצק מורכב עירוי בשר, קזאין חומצה peptone, עמילן, אגר מים מזוקקים. מדיום זה מאפשר צמיחה מיקרוביאלית מצוינת עבור רוב החיידקים הגדלים במהירות.

הוא נוצר במקור על ידי ג'ון האוורד מולר וג'יין הינטון כדי לבודד חיידקים תובעניים תזונתיים כמו Neisseria gonorrhoeae ו- Neisseria meningitidis. עם זאת, בשל מאפייניה, התברר שהוא אידיאלי לחקר הרגישות לאנטיביוטיקה, ומספק תוצאות אמינות וניתנות לשחזור.

אנטי-ביוגרמות (אגר מולר הינטון). מקור: ד"ר גרהם בירדס ב- en.wikipedia

לפיכך, מולר הינטון אגר הוא המדיום התרבותי המקובל על ידי מכון התקנים הקליניים והמעבדים (CLSI) והוועדה האירופית לבדיקת רגישות אנטי מיקרוביאלית, לביצוע מבחן הרגישות האנטי מיקרוביאלית בשיטת קירוב הדיסק של קירבי. באואר.

בָּסִיס

בהיותו מדיום תזונתי לא סלקטיבי, הוא מצוין לגידול של רוב החיידקים הפתוגניים.

מצד שני, ההרכב הפשוט שלה הופך את החומרים לפיזור קל עליו, והיה מאפיין חיוני לבדיקת הרגישות בשיטת דיפוזת הדיסק.

אחד המאפיינים האחרים שלו הוא בכך שהוא מכיל כמות נמוכה של מעכבים, המאפשרים הערכה יעילה של סולפונאמידים, טרימתופרים וטטרציקלינים.

עם זאת, יש לזכור כי המדיום צריך לעמוד בתנאים מסוימים כדי להבטיח את תפקודו התקין, כולל:

התאמת החומציות, עומק האגר והריכוז המתאים של תימין, תימידין, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ ו- Zn ⁺⁺ .

עליכם לדעת כי המתודולוגיה היא סטנדרטית ולכן יש לעמוד בכל הפרמטרים, כגון:

ריכוז החיסון, ריכוז ושימור הדיסקים האנטיביוטיים, מיקום המספר המתאים של הדיסקים על האגר, המרחק בין דיסק אחד למשנהו, המיקום האסטרטגי של אנטיביוטיקה מסוימת, האווירה, הטמפרטורה והזמן של דְגִירָה.

הכנה

שוקלים 37 גרם של מדיום מיואל הינטון מיובש וממיסים בליטר של מים מזוקקים. מחממים את המדיום תוך כדי בחישה כדי לעזור בפירוק. מרתיחים למשך דקה.

החיטוי לעיקור בטמפרטורה של 121 מעלות למשך 15 דקות. כאשר מוציאים את החיטוי, יש להכניס את הבקבוק לאמבט מים על 50 מעלות צלזיוס. שופכים 25 עד 30 מ"ל לתבניות פטרי סטריליות בקוטר 10 ס"מ.

על הפלטות להיות בעובי ממוצע של 4 מ"מ (אידיאלי), מותר לטווח של 3-5 מ"מ.

אם רצוי להכין אגר דם בעזרת אגר Müeller Hinton כבסיס, שפכו 5% דם כבש סטרילי ומפוצץ לפני ההגשה על הצלחות.

ה- pH הסופי של המדיום צריך להיות בין 7.2 ל 7.4.

השקיעו ושמרו במקרר עד לשימוש. אפשר לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

צבע המדיום המוכן הוא בז 'בהיר.

יישומים

הוא משמש לביצוע בדיקת הרגישות לאנטיביוטיקה או לטיפול באנטיביוטיקה עבור מרבית הפתוגנים הבלתי דורשים הצומחים במהירות.

אם אגר משלים בדם, הוא משמש לביצוע האנטיביוגרם של מיקרואורגניזמים תובעניים כגון: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, בין היתר. זה שימש גם לבידוד Legionella pneumophila.

טכניקת אנטי-ביוגרמה

לפני ביצוע antibiogram, השווה הפתרון חיידקי עד 1.5 x 10 ⁸ תאים חייב להיות מוכן .

לשם כך נלקחים ומושעים 3 עד 4 מושבות מהתרבות הטהורה בתוך מרק טריפטיקז סויה או במרק מולר הינטון, מודגרים במשך שעתיים עד 6 שעות והריכוז מותאם עם מלח סטרילי, ומשווה אותו לתקן Mac Farland של 0.5%.

אם הם דורשים מיקרואורגניזמים, ניתן להשעות מושבות ישירות עד ריכוז של 0.5% מק פארלנד. לאחר מכן, זרעית Müeller Hinton זורעת בספוגית ספוגה בתמיסה החיידקית המוכנה.

לשם כך הטבילה טבולה בתמיסה ואז מוסרים עודפי נוזלים על ידי לחיצה על דפנות הצינור. מייד לאחר מכן מועבר הספוגית על פני השטח כולו, ולא משאיר מקומות ללא מגע, ואז הצלחת מסתובבת מעט והיא זורעת שוב. הפעולה חוזרת על עצמה פעמיים נוספות.

בואו נמשך 10 דקות ואז הכנסו את הדיסקים האנטיביוטיים במלקחיים סטריליים, והשאירו רווח של 24 מ"מ ביניהם. לאחר הנחת כל דיסק על האגר, לחץ קל על כל דיסק עם המלקחיים כדי להבטיח שהם דבקים היטב.

לאחר סיום התהליך, הפלטה הופכת ודוגרת ב 35-37 מעלות צלזיוס באירוביוזה למשך 16 עד 18 שעות. אם מדובר במיקרואורגניזם תובעני, הוא עשוי לזכות במיקרואירופיליה ואם האנטי-ביוגרמה מכילה דיסקי אוקסילין, יש לקרוא אותה לאחר 24 שעות.

סרגל משמש למדידת הקוטר של כל הילה. יש לרשום את התוצאות במ"מ. בהמשך, הערכים המתקבלים מתואמים עם טבלאות נקודות הניתוק שפורסמו על ידי מדריך CLSI הנוכחי.

מדידת הילה מעכבת. מקור: USCDCP, Pixnio.com

דווח כרגישים (S), ביניים (I) או כעמידים (R), לפי העניין.

אנטיביוטיקה נבחרת על פי המיקרואורגניזם המבודד וסוג הזיהום שהוא מייצר.

לפעמים יש לזכור את המיקום האסטרטגי של אנטיביוטיקה כדי לחשוף דפוסי התנגדות פנוטיפיים.

מיקום דיסק אסטרטגי באגר של מולר הינטון

לגבי enterobacteria, יש למקם את דיסק החומצה הקלאבולינית כנגד הצפלוספורינים מהדור השלישי והרביעי. הרחבה בצורת ביצה מצביעה על כך שהזן הוא יצרנית בטא-לקטמאזות ספקטרום מורחב (ESBL). משמעות הדבר היא כי אין לטפל בחולה באמצעות צפלוספורינים.

ביטוי פנוטיפי של ייצור בטא-לקטמאז (ESBL) ספקטרום מורחב בגזע Escherichia coli. מקור: תמונה שצולמה על ידי הסופר MSc. מריאלסה גיל

בסטפילוקוקוס חשוב למקם את דיסק האריתתרומיצין או האזיתרומיצין לפני דיסק הקלינדמיצין (בדיקת D).

הילה עמידה באריתרומיצין ושטוח בהילה הקלינדמיצין מעידים על כך שהזן הוא בעל עמידות בפני קלינדמיצין המושרה מהזן (ICR). משמעות הדבר היא שטיפול clindamycin לא יהיה יעיל.

כדי לחפש זני AMP C הניתנים לזרימה ב- Enterobacteriaceae וכמה מוטות גראם-שליליים שאינם מותססים, מתמודדים נגד דיסק imipenem, במרחק של 27 מ"מ.

הילה משוטחת באחד הדיסקים הניצבים בפני imipenem מעידה על נוכחות של AMP C.

בחיפוש אחר C-AMP מכונן, דיסק קלוקסצילין 500 מ"ג מתמודד עם ceftazidime (30 מיקרוגרם) ועם cefotaxime (30 מיקרוגרם), במרחק של 25 מ"מ. הילה מורחבת באף אחד מהצפלוספורינים מעידה על חיוביות.

ניתן להחליף את דיסק קלוקסצילין גם בדיסק 9 מ"מ של נייר פילטר Whatman מס '6, הספוג בחומצה פנילית בורית (400 מיקרוגרם), המרחק של 18 מ"מ. זה מתפרש כמו הקודם.

לבסוף, כדי לחקור את הייצור של מתכות מתכת -etalactamases במיוחד ב- Pseudomonas aeruginosa, נעשה שימוש בדיסק הספוג 10 μl של חומצה אתילנדימינטטר-אצטטית (EDTA 750 מיקרוגרם) וחומצה תיוגליקולית (SMA 300 μg) העומדת מול הדיסקים imipenem ו- meropenem, במרחק של 15 מ"מ.

הבדיקה חיובית אם יש הרחבת הילות imipenem או meropenem לכיוון דיסק EDTA / SMA. יש לאשר תוצאה זו על ידי מבחן הודג 'ששונו.

שיטה זו מורכבת מחיסול זן Escherichia coli ATCC 25922 על צלחת מולר הינטון. דיסק צלחת imipenem ממוקם במרכז הצלחת ואז נעשה פס מהדיסק לפריפריה עם זן ה- P. aeruginosa החשוד. ניתן לבדוק עד 4 זנים בכל צלחת.

הבדיקה תהיה חיובית אם יש אזור של עיוות של הילה imipenem סביב סימן המתיחה.

הגורמים לתוצאות שגויות

- דיסקיות אנטיביוטיות שהשתמרו בצורה לא טובה עלולות לייצר עמידות כוזבת. לדוגמא, דיסק האוקסצילין פגיע מאוד לשינויים בטמפרטורה.

- pH של המדיום שמתחתיו המצוין (חומצי) מייצר הילות קטנות יותר באמינוגליקוזידים ובמקרולידים (סיכון להתנגדות כוזבת), והילות גדולות יותר בפניצילין, טטרציקלין ונובוביוסין (סיכון לרגישות כוזבת).

-אם ה- pH הוא מעל המצוין (אלקליין) ההשפעות שתוארו לעיל הופכות.

למדיה עם ריכוזי תימין ותימידין גבוהים יש השפעה על ידי הפחתה משמעותית של הילות העיכוב של סולפונמידות וטרימתופרים.

-ריכוזים גבוהים של סידן ומגנזיום מייצרים עמידות כוזבת של אמינוגליקוזידים, פולימיקסין B וטטרציקלינים כנגד זנים של Pseudomonas aeruginosa.

ריכוזים נמוכים של סידן ומגנזיום מייצרים רגישויות כוזבות של אמינוגליקוזידים, פולימיקסין B וטטרציקלינים כנגד זנים של Pseudomonas aeruginosa.

נוכחות אבץ משפיעה על תוצאות דיסקי קרבפנם (imipenem, meropenem ו- ertapenem).

עובי המדיום שמתחת ל -3 מ"מ יביא לתוצאות רגישות כוזבת, בעוד שעובי מעל 5 יביא להתנגדות שקרית.

- גיוס הדיסקים באנטיביוגרם ייתן הילות מעוותות, מכיוון שהפרשת אנטיביוטיקה הינה מיידית.

- חיסונים חלשים מאוד משפיעים על התוצאות, מכיוון שלא יהיה צמיחה אחידה או מפוזרת באגר, תנאי הכרחי בכדי להיות מסוגל למדוד את הילות העיכוב, בנוסף לעובדה שההילות יכולות לתת גדול מהרגיל.

-חיסון עמוס בכל יכול לתת הילות קטנות מהרגיל.

-לא כיבוד המרחק בין דיסקים גורם להילה אחת לחפיפה זו עם זו ולא ניתן לקרוא אותם נכון.

הדגירה עם CO ₂ מגדילה את גודל ההילות של דיסקי הטטרציקלין והמתילין.

הדגירה בטמפרטורות שמתחת ל 35 מעלות צלזיוס מייצרת הילות גדולות יותר.

-תוספת הדם מקטינה את גודל ההילה הסולפה.

הַגבָּלָה

הרגישות של אנטיביוטיקה שהודגמה באנטיביוגרמה כנגד מיקרואורגניזם (במבחנה) אינה מהווה ערובה לכך שהיא תעבוד in vivo.

QA

כדי לדעת אם המדיום מכיל כמות מספקת של תימין, יש לשתול זן של Enterococcus faecalis ATCC 29212 ולבדוק את הרגישות לטרימטופרים סולפמתוקאזול (SXT), עליו לתת הילה שווה או 20 מ"מ כדי להיות משביעת רצון.

הפניות

1. "אגר מולר-הינטון." ויקיפדיה, האינציקלופדיה החופשית. 16 נובמבר 2018, 12:23 UTC. 27 בינואר 2019, 04:22
2. פורבס B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). אבחון מיקרוביולוגי של ביילי וסקוט. 12 ed. עריכה Panamericana SA ארגנטינה.
3. קונה E. תנאים למחקר רגישות טוב על ידי מבחן דיפוזר אגר. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. מעבדת דיפקו פרנסיסקו סוריה מלגיזו. אגר מולר הינטון עם 5% דם כבשים. 2009. זמין בכתובת: http://f-soria.es
5. מעבדת BD Müeller Hinton II Agar. 2017. זמין בכתובת: .bd.com
6. מעבדות בריטניה. אגר מולר הינטון. 2015. ניתן להשיג ב: britanialab.com
7. Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. מהדורה חמישית עריכה Panamericana SA ארגנטינה.
8. מרטינז-רוג'ס ד. Betaactamases מסוג AmpC: כלליות ושיטות לגילוי פנוטיפי. הכמרית סגן וונ. מיקרוביול. 2009; 29 (2): 78-83. ניתן להשיג ב: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. גילוי פנוטיפי של metallobetalactamases בבודדים קליניים של Pseudomonas aeruginosa. קסמרה, 2012; 40 (2): 113-121. ניתן להשיג ב: scielo.org.