DNA רקומביננטי: טכניקה, יישומים ויסודות - ביולוגיה - 2025

ה- DNA רקומביננטי (rDNA או rDNA) הוא מולקולת חומצה גרעינית מלאכותית שנוצרה במעבדה, על ידי שילוב של שני מגזרים של ארגוני עניין. זה ידוע גם בשם DNA כימרי, הודות לתכונה ההיברידית שלו. DNA מסוג זה לא נמצא בטבע.

המתודולוגיה הבסיסית לייצורו כוללת: (א) בחירת DNA יעד, והחדרתו לשבר DNA אחר (בדרך כלל פלסמיד חיידקי); (ב) הכנסת פלסמיד זה לחיידק, (ג) בחירת החיידקים באמצעות אנטיביוטיקה ולבסוף (ד) ביטוי הגן.

מקור: pixabay.com

הטכניקה מנצלת מערך אנזימים המאפשרים העתקה והדבקה של שברי DNA ספציפיים על פי שיקול דעתו של החוקר.

המטרה של טכנולוגיה רקומביננטית היא, ברוב המקרים, ביטוי של חלבון (המכונה חלבון רקומביננטי) הרצוי על ידי הביולוג המולקולרי למחקר עתידי או ליצור חלבון בעל ערך מסחרי וטיפולי - כמו אינסולין אנושי, לדוגמה.

היסודות של טכניקת ה- DNA רקומביננטית ושימוש בה בהנדסה גנטית

הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית

כל היצורים האורגניים שאנו מכירים חולקים כמה מאפיינים. אחד מהם הוא אופי החומר הגנטי ואופן ייצורם של חלבונים - תהליך המכונה "הדוגמה" המרכזית של הביולוגיה המולקולרית.

למעט כמה וירוסים, כל האורגניזמים מאחסנים מידע גנטי ב- DNA (חומצה deoxyribonucleic), שנאספו בצורה קומפקטית ומאורגנת מאוד בגרעין התא.

לצורך ביטוי גנים, מולקולת ה- DNA מועתקת ל- RNA של שליח, והאחרונה מתורגמת לשפה של חומצות אמינו, אבני הבניין של חלבונים.

מהו DNA רקומביננטי?

בין שנות השבעים והשמונים, ביולוגים מולקולריים החלו לנצל את התהליכים המתרחשים באופן טבעי בתא והצליחו להוציא אותם למעבדה.

בדרך זו, ניתן להכניס גן מבעלי חיים (חולין, למשל) לקטע של DNA מחיידק; או שניתן היה לשלב DNA של חיידק עם DNA ויראלי. כך, אנו יכולים להגדיר DNA רקומביננטי כמולקולה המורכבת מ- DNA משני אורגניזמים שונים.

לאחר שנוצרה מולקולה היברידית או רקומביננטית, מתבטא הגן המעניין. במילה ביטוי אנו רוצים להתייחס לתהליך התרגום לחלבון.

אנזימי הגבלה וליגזות: המפתח לתהליך

גורם מרכזי בפיתוח טכנולוגיית DNA רקומביננטי היה גילוי אנזימי הגבלה.

מדובר במולקולות חלבון המציגות את היכולת לקטר DNA (גרעינים) לרצפים ספציפיים המשמשות כ"מספריים מולקולריים ". השברים הנוצרים על ידי אנזימים אלו נקראים שברי הגבלה.

אנזימים אמריים יכולים לייצר חתכים סימטריים ברצף היעד (בשתי השרשראות באותו גובה) או חתכים אסימטריים. היבט מרכזי בפעולה של אנזימי הגבלה הוא שלאחר מחשוף השרשראות מתקבל "קצה רופף", המשלים לקצה השני שנחתך על ידי אותו אנזים.

כמה דוגמאות הן ECOR 1 ו- Sma 1. נכון לעכשיו יותר מ- 200 סוגים של אנזימי הגבלה ידועים וזמינים מסחריים.

כדי להיות מועילים, מספריים חייבים להיות מלווים בדבק. פעולת איטום זו של ה- DNA (שטופלה בעבר באנזימי הגבלה) מתבצעת על ידי ליגזות.

טכניקה: כיצד משתנים DNA של אורגניזם באופן מלאכותי במעבדה?

להלן נתאר את הצעדים העיקריים שדורשת טכנולוגיית DNA רקומביננטית. כולם מבוצעים על ידי אנשי מקצוע במעבדה לביולוגיה מולקולרית.

מהו "שיבוט"?

לפני שנמשיך בפרוטוקול הניסוי, עלינו לציין כי בביולוגיה מולקולרית ובביוטכנולוגיה משתמשים במונח "שיבוט" והפועל "שיבוט". זה יכול להוביל לבלבול.

בהקשר זה איננו מתכוונים לשיבוט של אורגניזם שלם (כמו במקרה של דולי הכבשה המפורסמת, למשל), אלא לשיבוט של פיסת DNA שיכולה להיות גן. כלומר, הפקת עותקים רבים - זהים גנטית - של הרצף.

1. בידוד והשגת DNA

השלב הראשון הוא להחליט באיזה רצף תרצו להשתמש. זה תלוי לחלוטין בחוקר וביעדי עבודתו. לאחר מכן יש לבודד את ה- DNA הזה ולטהר אותו. השיטות והנהלים להשגה זו תלויים בתורם בגוף וברקמה.

באופן כללי נלקחת פיסת רקמה ומופעלת לטיפול במאגר ליזיס בעזרת חלבון K (אנזים פרוטאוליטי) ואז מיצוי ה- DNA. בהמשך, החומר הגנטי מפוצל לרסיסים קטנים.

2. וקטור השיבוט

לאחר שלבי ההכנה החוקר מבקש להכניס את קטע ה- DNA המעניין לקטור שיבוט. מעכשיו נקרא פלח זה של DNA לבן לבן.

פלסמידים

אחד הווקטורים הנפוצים ביותר בפלסמיד ממוצא חיידקי. פלסמיד הוא מולקולת DNA מעגלית כפולת חוטים שנמצאת באופן טבעי בחיידקים. הם זרים לכרומוזום החיידקי - כלומר הם אקסטרכרומוזומים, ונמצאים באופן טבעי בפרוקריוטים אלה.

האלמנטים הבסיסיים של וקטור הם: (א) מקור שכפול, המאפשר סינתזת DNA; (ב) גורם הברירה, המאפשר לזהות את האורגניזמים הנושאים את הפלסמיד עם ה- DNA היעד, כמו עמידות לאנטיביוטיקה מסוימת; ו- (ג) אתר רב-שכבתי, בו נמצאים הרצפים שיוכרו על ידי אנזימי ההגבלה.

ה- DNA הרקומביננטי הראשון המוצלח במעבדה הועבר לשכפול פלסמיד pSC101 מהחיידק E. coli. זה מכיל אתר הגבלה לאנזים ההגבלה EcoRI וגן לעמידות לאנטיביוטיקה, בנוסף למקור ההעתקה.

החדרת DNA המטרה בפלסמיד מתבצעת באמצעות כלים מולקולריים של אנזימי הגבלה וליגסים שתוארו בסעיף הקודם.

סוגי וקטור שנותרו

מלבד פלסמידים, ניתן להכניס DNA לווקטור אחר, כמו למשל חיידקים חיידקים, קוסמידים, YACs (כרומוזומים מלאכותיים של שמרים), BACs (כרומוזומים מלאכותיים של חיידקים) ופגמידות.

3. הצגת DNA רקומביננטי

לאחר שמתקבלת מולקולת ה- DNA הרקומביננטי (גן המעניין בפלסמיד או בווקטור אחר), הוא מוחדר לארח או מארגניזם מארח, שיכול להיות חיידק.

כדי להכניס DNA זר לחיידק, משתמשים בטכניקה שנקראת טרנספורמציה של חיידקים, שם האורגניזם נתון לטיפול עם קטיונים דו-ערכיים, ההופך אותו לרגיש לספיגת ה- DNA.

באופן מתודולוגי, איננו יכולים להבטיח כי 100% מהחיידקים בתרבות שלנו תפסו ביעילות את מולקולת ה- DNA הרקומביננטי שלנו. כאן נכנס לתמונה החלק של הפלסמיד המכיל עמידות לאנטיביוטיקה.

כך, החיידקים שנטלו את הפלסמיד יהיו עמידים לאנטיביוטיקה מסוימת. כדי לבחור בהם, יהיה זה מספיק למרוח אנטיביוטיקה כאמור ולקחת את השורדים.

4. "קציר" את החלבון

לאחר בחירת החיידקים עם ה- DNA הרקומביננטי שלנו, אנו ממשיכים להשתמש במכונות האנזימטיות של המארח כדי לייצר את המוצר החלבוני המעניין. ככל שהחיידקים מתרבים, הפלסמיד מועבר לצאצאיהם, ולכן הוא לא הולך לאיבוד במהלך החלוקה.

בהליך זה משתמשים בחיידקים כסוג של "מפעל" לחלבון. בהמשך נראה כי מדובר בהליך רלוונטי ביותר בפיתוח טיפולים רפואיים יעילים.

ברגע שהתרבות מוכנה והחיידקים ייצרו כמויות גדולות של חלבון, התא מוחל או מופרע. יש מגוון רחב של טכניקות ביוכימיות המאפשרות טיהור של חלבונים על פי המאפיינים הפיזיקוכימיים שלהם.

בהקשר ניסיוני אחר, יתכן שאנו לא מעוניינים לייצר את החלבון, אלא אנו מעוניינים להשיג את רצף ה- DNA כשלעצמו. אם זה היה המקרה, הפלסמיד ישמש ליצירת עותקים מרובים של שבר העניין כדי שיהיה מספיק מ- DNA היעד כדי לבצע את הניסויים הרלוונטיים.

יישומים

טכנולוגיית DNA רקומביננטית פתחה מספר אינסופי של אפשרויות בביולוגיה מולקולרית, ביוטכנולוגיה, רפואה ותחומים קשורים אחרים. היישומים הבולטים ביותר שלה הם הבאים.

ניתוח גנטי

היישום הראשון קשור ישירות למעבדות לביולוגיה מולקולרית. טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי מאפשרת לחוקרים להבין את התפקוד התקין של הגנים, וניתן להשתמש בחלבונים הנוצרים במחקר נוסף.

תעשיית התרופות

לחלבונים המיוצרים בשיטת ה- DNA רקומביננטי יש יישומים ברפואה. שתי דוגמאות רלוונטיות מאוד בתחום הן אינסולין אנושי והורמון גדילה, המיושם בחולים חסרי חלבון זה.

הודות ל- DNA רקומביננטי ניתן לייצר חלבונים אלה ללא צורך להוציא אותם מאדם אחר, המייצג סיבוכים מתודולוגיים נוספים וסיכונים בריאותיים. זה עזר בשיפור איכות החיים של אינספור חולים.

הפניות

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). ביולוגיה 2. גרפו פטריה עורך.
2. קופר, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). התא: גישה מולקולרית (כרך 10). וושינגטון הבירה: עיתונות ASM.
3. Devlin, TM (2004). ביוכימיה: ספר לימוד עם יישומים קליניים. התהפכתי.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). תפקיד טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטית לשיפור החיים. כתב העת הבינלאומי לגנומיקה, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). אנטומיה פתולוגית. אלסביאר ספרד.
6. טורטורה, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). מבוא למיקרוביולוגיה. פנמריקנית רפואית אד.
7. The, MJ (1989). אינסולין אנושי: התרופה הראשונה של טכנולוגיית ה- DNA. כתב העת האמריקני לרוקחות מערכת הבריאות, 46 (11_suppl), S9-S11.