כתם ZIEHL-NEELSEN: רציונל, ריאגנטים וטכניקה - ביולוגיה - 2025

ה- Ziehl-Neelsen הוא טכניקת צביעה לזיהוי חומצת אלכוהול עמידה למיקרואורגניזמים (ARA). שמו של הליך מיקרוביולוגיה זה מתייחס למחבריו: החיידק פרנץ זייל והפתולוג פרידריך נילסן.

טכניקה זו היא סוג של מכתים דיפרנציאליים, המרמזת על שימוש בצבעים שונים על מנת ליצור ניגודיות בין המבנים שתרצו להתבונן בהם, להבדיל בהמשך ולזהות אותם. הכתם Ziehl-Neelsen משמש לזיהוי סוגים מסוימים של מיקרואורגניזמים.

כתם Ziehl-Neelsen

חלק מהאורגניזמים הללו הם mycobacteria (למשל, Mycobacterium tuberculosis), Nocardia (למשל, Nocardia sp.), וחלקם טפילים חד-תאיים (למשל, Cryptosporidium parvum). ניתן לסווג רבים מהחיידקים באמצעות טכניקה נפוצה הנקראת כתם גראם.

עם זאת, קבוצות חיידקים מסוימות דורשות שיטות אחרות כדי להיות מסוגלים לזהות אותם. טכניקות כמו כתם Ziehl-Neelsen דורשות שילובי צבעים עם חום כדי לקבע את הראש לדופן התא.

ואז מגיע תהליך הלבנה המאפשר שתי תוצאות: עמידות או רגישות לשינוי צבע על ידי חומצות ואלכוהולים.

בָּסִיס

הרציונל לטכניקת מכתים זו מבוסס על תכונות דופן התא של מיקרואורגניזמים אלה. הקיר מורכב מסוג של חומצות שומן הנקראות חומצות מיקוליות; אלה מאופיינים בכך שיש להם שרשראות ארוכות מאוד.

כאשר לחומצות שומן יש מבנים ארוכים מאוד, הן יכולות לשמור על צבעים בקלות רבה יותר. יש סוגים חיידקיים שקשה מאוד להכתים על ידי כתם גראם, בגלל התוכן הגבוה של חומצות מיקוליות בדופן התא.

הכתם Ziehl-Neelsen משתמש בתרכובת הפנולית קרבול פוקסין, כתם בסיסי. יש לזה יכולת לקיים אינטראקציה עם חומצות השומן של דופן התא, שעשויה במרקם בטמפרטורת החדר.

מכתים של פוקסין בקרבול משופרים בנוכחות חום, מכיוון שהשעווה נמסה ומולקולות הצבע עוברות במהירות רבה יותר אל דופן התא.

החומצה המשמשת בהמשך משמשת לצבעוניות של תאים שלא הוכתמו מכיוון שקירם לא היה קשור מספיק לצביעה; לכן כוחו של אקונומיקה מסוגל להסיר את צבע החומצה. תאים העומדים בפני שינוי צבע זה נקראים מהיר-חומצה.

צבעוני משני

לאחר דה-גוון הדגימה היא מנוגדת לצבע אחר הנקרא צבע משני. בדרך כלל משתמשים בכחול מתילן או בירוק מלכיט.

הצבע המשני מכתים את חומר הרקע וכתוצאה מכך יוצר ניגוד למבנים שהוכתמו בשלב הראשון. רק תאים לא-צבועים סופגים את הצבע השני (דלפק צבעוני) ולובשים את צבעם, בעוד שתאים מהירים בחומצה שומרים על צבעם האדום.

הליך זה משמש לעיתים קרובות לזיהוי שחפת Mycobacterium ו- Mycobacterium leprae, הנקראים Bacilli-fast acid.

מגיבים

צבעוני ראשוני

משתמשים ב 0.3% פוקסין קרבול (מסונן). צבע זה מוכן מתערובת של אלכוהולים: פנול באתנול (90%) או מתנול (95%), ובתערובת זו מומסים 3 גרם פוקסין בסיסי.

תמיסת הלבנה

בשלב זה ניתן להשתמש בפתרונות של 3% חומצה אלכוהולית או 25% חומצה גופרתית.

צבע משני (צבע נגדי)

הצבע המשמש ביותר בניגוד לדגימות הוא בדרך כלל 0.3% כחול מתילן. עם זאת, ניתן להשתמש גם באחרים, כגון 0.5% ירוק מלכיט.

טֶכנִיקָה

הליך מכתים מהיר-חומצה

הכינו מריחת חיידקים

תכשיר זה נעשה בשקופית נקייה ויבשה, בעקבות אמצעי זהירות לעקרות.

ייבוש מריחה

אפשר למריחה להתייבש בטמפרטורת החדר.

מחממים את הדגימה

יש לחמם את הדגימה על ידי הפעלת אש על השקופית שמתחת. קיבוע אלכוהול יכול להיעשות כאשר המריחה לא הוכנה עם כיח (מטופלים בנתרן היפוכלוריט כדי להלבין אותו) ואם הוא לא מתכוון להכתים מיד.

שחפת מ 'מוסרת בעזרת אקונומיקה ובמהלך תהליך ההכתמה. קיבוע חום של כיח לא מטופל לא יהרוג את שחפת M. ואילו קיבוע אלכוהול הוא קוטל חיידקים.

מכסים את הכתם

הכתם מכוסה בתמיסת פוקסין קרבול (כתם בסיסי ראשוני).

מחממים את הכתם

זה נעשה במשך 5 דקות. עליכם לשים לב להתפתחות אדים (כ- 60 מעלות צלזיוס). חשוב לא להתחמם יתר על המידה ולהימנע משריפת הדגימה.

בכל הנוגע לחימום הכתם, יש להקפיד מאוד על חימום הפולסין של קרבול, במיוחד אם הכתמה מתבצעת על מגש או מיכל אחר בו נאספו כימיקלים דליקים מאוד מהכתמה הקודמת.

יש למרוח רק להבה קטנה מתחת לשקופיות בעזרת ספוגית שהודלקה קודם לכן, לחה בכמה טיפות של אלכוהול חומצי, מתנול או אתנול 70%. הימנע משימוש בספוגית גדולה הספוגה באתנול מכיוון שמדובר בסכנת שריפה.

שוטפים את הכתם

יש לבצע שטיפה זו במים נקיים. אם מי הברז אינם נקיים, יש לשטוף את המריחה במים מסוננים או מזוקקים, רצוי.

מכסים את המריחה באלכוהול חומצי

אלכוהול חומצי זה אמור להיות 3%. הכיסוי מתבצע במשך 5 דקות או עד למריחת צבע מספיק מספקת, כלומר בצבע ורוד בהיר.

יש לקחת בחשבון שאלכוהול חומצי הוא דליק; לכן יש להשתמש בזה בזהירות רבה. הימנע מלהיות בקרבת מקורות הצתה.

שוטפים את הכתם

הכביסה צריכה להיות במים נקיים ומזקקים.

מכסים את המריחה בכתם

זה יכול להיות כתם ירוק מלכיט (0.5%) או כחול מתילן (0.3%) למשך 1 עד 2 דקות, תוך שימוש בזמן הארוך יותר אם המריחה דקה.

שוטפים את הכתם

שוב יש להשתמש במים נקיים (מזוקקים).

לספוג

יש לנקות את החלק האחורי של השקופית ולהניח את הכתם על מתלה ניקוז לייבוש באוויר (אל תשתמש בנייר סופג לייבוש).

בחן את המריחה מתחת למיקרוסקופ

יש להשתמש במטרה 100X ושמן טבילה. סרוק את המריחה באופן שיטתי ורשום את התצפיות הרלוונטיות.

פרש את התוצאות

תיאורטית, מיקרואורגניזמים המכתים צבע אדמדם נחשבים לחיוביים מהירים בחומצה (AAR +).

נהפוך הוא, אם המיקרואורגניזמים מכתימים כחול או ירוק, תלוי בצבע המשמש כצבע נגדי, הם נחשבים לשליליים מהירה של חומצה (AAR-).

הפניות

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). יסודות המיקרוביולוגיה המעשית (מהדורה ראשונה). הוצאה לאור רפואית של האחים ג'ייפי.
2. באומן, ר '(2014). מיקרוביולוגיה עם מחלות על ידי מערכת גוף (מהדורה רביעית). פירסון חינוך בע"מ
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). מיקרוביולוגיה מבוא (מהדורה ראשונה). הוצאת אוניברסיטת קיימברידג '.
4. מורלו, ג'יי, גרנדו, פ. ווילסון, מ 'ומורטון, ו' (2006). מדריך מעבדה וחוברת עבודה במיקרוביולוגיה: יישומים לטיפול בחולים (מהדורה 11). McGraw-Hill חינוך.
5. Vasanthakumari, R. (2007). ספר לימוד למיקרוביולוגיה (מהדורה ראשונה). פרסומי BI PVT.