כתם בג'ימסה: רציונל, חומרים, טכניקה ושימושים - ביולוגיה

צביעת גימזה הוא סוג של צביעה דגימות קליניות, מבוסס על תערובת של צבעי חומצה ובסיסיים. יצירתו נוצרה בהשראת העבודה שנעשה על ידי רומנובסקי, שם גוסטב ג'יימסה, כימאי ובקטריולוג במקור מגרמניה, שיכלל אותה על ידי הוספת גליצרול לייצוב התרכובות.

השינויים שנוצרו בטכניקת הרומנובסקי המקורית אפשרו לשפר משמעותית את התצפיות המיקרוסקופיות, לכן הטכניקה הוטבלה בשם הכתם Giemsa.

דוגמאות שונות מוכתמות בכתם ג'יימסה. א. Trypanosoma evansi בדם היקפי. תאי דם תקינים. ג. בוריליה תאילרי בדם היקפי. לימפומה של ד. בורקיט.

מכיוון שמדובר בטכניקה פשוטה לביצוע, פונקציונלית וחסכונית מאוד, היא משמשת כיום במעבדה הקלינית למריחות המטולוגיות, דגימות מח עצם וקטעי רקמות.

טכניקת הכתמת Giemsa שימושית מאוד למחקרים ציטולוגיים, מכיוון שהיא מאפשרת התבוננות במבני תאים ספציפיים. טכניקה זו מכתים את הציטופלסמות, הגרעינים, נוקליאולים, ווקולות ותאי גרגירים של תאים, ויכולה להבחין אפילו בין עקבות כרומטין.

יתרה מזאת, ניתן לאתר שינויים משמעותיים בגודל, בצורתו או בצבעו של הגרעין, כאשר ניתן לדמיין את אובדן הקשר בין גרעין-ציטופלזמה.

מצד שני, היא מאפשרת לזהות תאים לא בשלים במח העצם ובדם היקפי, והיא חשובה לאבחון מחלות קשות כמו לוקמיה. ניתן גם לאתר המופרזיטים, חיידקים נוספים ותוך תאיים, פטריות, בין היתר.

בציטוגנטיקה נעשה שימוש נרחב, מכיוון שניתן ללמוד את המיטוזה של התאים.

בסיס מכתים בג'ימסה

צבעים מסוג רומנובסקי מבוססים על שימוש בניגודיות בין צבעים חומציים ובסיסיים, כדי להשיג מכתים במבנים הבסיסיים והחומציים בהתאמה. כפי שניתן לראות, יש זיקה של צבעי חומצה לכתמת מבנים בסיסיים ולהיפך.

הצבע הבסיסי המשמש הוא כחול מתילן ונגזרותיו המחומצנות (תכלת A ותכלת B) ואילו צבע החומצה הוא אאוזין.

מבני החומצה של התאים הם חומצות הגרעין, גרגרי הבסופילים המפולחים, בין היתר, ולכן הם יוכתמו בכחול מתילן.

באותה מובן זה, המבנים הבסיסיים של התאים הם המוגלובין וכמה גרגירים כמו אלה הכלולים באאוזינופילים מפולחים, בין היתר; אלה יוכתמו באוזין.

מצד שני, בשל העובדה שכחול מתילן ותכלת מאופיינים בכך שהם צבעי מטאכרומטיות, הם יכולים לספק גוון משתנה למבנים השונים בהתאם לעומס הפוליאניונים שיש ברשותם.

כך מצליח השילוב האסטרטגי של צבעי בסיס וחומצה לפתח מגוון רחב של צבעים, בהתאם למאפיינים הביוכימיים של כל מבנה, לעבור בגוונים כחולים בהירים, כחולים כהים, לילך וסגול במקרה של מבני חומצה.

בעוד שהצבע הניתן על ידי eosin יציב יותר, ויוצרים צבעים בין כתום אדמדם וסלמון.

חומרים

חומרים להכנת פתרון המניות

הכנת תמיסת המניה מחייבת משקל של 600 מ"ג של כתם ג'יימס אבקה, מדידת 500 סמ"ק מתיל אלכוהול נטול אצטון ו -50 סמ"ק גליצרין ניטרלי.

כיצד להכין את פתרון המניות

הניחו את אבקת הג'ימסה הכבדה בתוך טיט. אם יש גושים יש לרסס אותם. בהמשך להוסיף כמות ניכרת של גליצרין שנמדד ולערבב היטב. התערובת המתקבלת מוזגת לבקבוק ענבר נקי מאוד.

שאר הגליצרין מונח במרגמה. מערבבים שוב לניקוי שאר הצבע שנצמד לקירות המרגמה ושופכים לאותה צנצנת.

מכוסה את הבקבוק ומונח באמבטיית מים בחום של 55 מעלות למשך שעתיים. בזמן שהוא באמבט מים, יש לנער בעדינות את התערובת כל חצי שעה בערך.

בהמשך מותר לתערובת להתקרר למקם את האלכוהול. בעבר, חלק מהאלכוהול המדוד מונח במרגמה כדי לסיים את שטיפת הצבע שנותר ואז הוא מתווסף לתערובת יחד עם שאר האלכוהול.

יש להשאיר תכשיר זה לבשל למשך שבועיים לפחות. יש לסנן את החלק המשומש של תמיסת המניות.

כדי למנוע זיהום של התכשיר, מומלץ להעביר את החלק שיהיה בשימוש מתמיד לבקבוק ענבר קטן עם טפטפת. מילוי מחדש בכל פעם שהגיבוי נגמר.

חומרים להכנת פתרון המאגר

מצד שני, פיתרון חיץ ב pH 7.2 מוכן באופן הבא:

שוקלים 6.77 גרם נתרן פוספט (נטול מים) (NaHPO ₄ ), 2.59 גרם פוספט אשלגן דיהידרוגן (KH ₂ PO ₄ ) ומים מזוקקים עד 1000 סמ"ק.

הכנה סופית של הצבע

לצורך הכנת תמיסת הסתימה הסופית נמדדים 2 מ"ל מתמיסת המניות המסוננת ומערבבים עם 6 מ"ל מתמיסת החיץ. מערבבים את התערובת.

עובדה רלוונטית שיש לקחת בחשבון היא שטכניקות הכנת הצביעה יכולות להשתנות בהתאם לחברה המסחרית.

חומרים נוספים הדרושים לביצוע הצביעה

מלבד החומרים המתוארים, עליכם להחזיק גשרים צבועים, חולצות עם מים או חיץ לשטיפה, מגלשות או כיסויים לחפצים, שעון עצר לשליטה בזמני הצביעה ונייר הקליעה או חומר כלשהו שניתן להשתמש בהם לייבוש ( גזה או כותנה).

טֶכנִיקָה

תהליך מכתים

1) לפני הכתמה, מריחת הדגימה חייבת להיות מוכנה בשקופית נקייה.

הדגימות יכולות להיות דם, מח עצם, קטעי רקמות היסטולוגיות או דגימות צוואר הרחם. מומלץ לממרחים להיות דקים ולייבוש של שעה או שעתיים לפני הצביעה.

2) על גשר צביעה, מקם את כל הסדינים שצריך לצבוע. אתה תמיד עובד באותו סדר וכל גיליון מזוהה היטב.

3) הניחו כמה טיפות של 100% אלכוהול מתיל (מתנול) על המריחה והניחו לו לפעול למשך 3 עד 5 דקות, על מנת לתקן ולהתייבש את הדגימה.

4) השלך את המתנול הקיים על הסדין ואפשר להתייבש באוויר.

5) לאחר היבשה, הניחו את פתרון הכתמים הסופי בעזרת טפטפת עד לכיסוי הגיליון כולו. השאירו לפעול למשך 15 דקות. יש מחברים שממליצים על עד 25 דקות. זה תלוי בבית העסק.

6) מסננים את הכתם ושטפו את המריחה במים מזוקקים או בעזרת תמיסת 7.2 חיץ.

7) על נייר קרש, הניחו לסדינים להתייבש באוויר הפתוח, מסודרים אנכית בעזרת תומך.

8) נקה את החלק האחורי של השקופית בעזרת מטלית אלכוהול או מטלית כותנה כדי להסיר עקבות כתמים.

כלי עזר

טכניקת הכתמה של Giemsa משמשת בתחומים שונים, כולל: המטולוגיה, מיקולוגיה, בקטריולוגיה, טפילות, ציטולוגיה וציטוגנטיקה.

המטולוגיה

זהו השימוש השכיח ביותר הניתן לכתם זה. בעזרתו ניתן לזהות כל אחד מהתאים שנמצאים במוח עצם או בדגימות דם היקפיות. כמו גם להעריך את מספר כל סדרה, להיות מסוגלים לאתר לוקוציטוזיס או לויקופניה, תרומבוציטופניה וכו '.

מכיוון שהוא רגיש בזיהוי תאים לא בשלים, הוא רלוונטי באבחון של לוקמיה חריפה או כרונית. ניתן גם לבצע אבחנה של אנמיה, כמו אנמיה חרמשית, תא מגל, בין היתר.

מיקולוגיה

באזור זה השימוש בו נפוץ בחיפוש אחר כמוסת Histoplasma (פטריה דימורפית תאית) בדגימות רקמות.

בַּקטֶרִיוֹלוֹגִיָה

במריחות המטולוגיות המוכתמות בג'ימסה ניתן לאתר Borrelias sp אצל חולים שנמצאים במחלה הנקראת קדחת חוזרת. Spirochetes יש בשפע בקרב אריתרוציטים, בדגימות שנלקחו בשיא החום.

ניתן גם לדמיין חיידקים תוך תאיים כמו Rickettsia sp ו- Chlamydia trachomatis בתאים נגועים.

טפילות

בתחום הטפילות, מכתים בג'ימסה אפשרו לאבחן מחלות טפיליות כמו מלריה, מחלת צ'אגאס ולישמניאזיס.

בשניים הראשונים ניתן לראות טפילים Plasmodium sp ו- Trypanosoma cruzi בהתאמה בדם ההיקפי של חולים נגועים, ניתן למצוא אותם בשלבים שונים, תלוי בשלב המחלה.

כדי לשפר את החיפוש אחר טפילים בדם, מומלץ להשתמש בכתם Giemsa המעורבב בכתם מאי-גרונוולד.

כמו כן, ניתן לאבחן לישמניאזיס עורית על ידי הערכת דגימות ביופסיה בעור מוכתמות בג'ימסה במקום בו נמצא הטפיל.

ציטולוגיה

מכתים בג'ימסה משמשים גם למחקר ציטולוגי של דגימות אנדו-צוואריות, אם כי זו אינה הטכניקה הנפוצה ביותר למטרה זו.

אך במקרים של מחסור במשאבים ניתן להשתמש בו, בעל פונקציונליות דומה לזו שמציעה טכניקת פפניקולאו ובעלות נמוכה יותר. עם זאת, הדבר מצריך מומחיות מצד הבודק.

ציטוגנטיקה

מאפיין רלוונטי של מכתים בג'ימסה הוא יכולתו להיקשר חזק לאזורים עשירים באדנין ותימין של DNA. זה מאפשר לדמיין את ה- DNA במהלך מיטוזה של התאים, במצבים שונים של עיבוי.

מחקרים אלה נחוצים לגילוי סטיות כרומטיות כגון כפילויות, מחיקות או טרנסלוקציות של אזורים שונים בכרומוזומים.

מחקרים המדגימים את יעילותו של כתם Giemsa

Cannova et al (2016), השוו בין 3 טכניקות מכתים לאבחון של leishmaniasis עורית.

לשם כך הם השתמשו בדגימות שהושגו מבעלי חיים ניסיוניים (Mesocrisetus auratus) שחוסמו בניסוי לישמניאס.

המחברים הדגימו כי הכתם בג'ימסה היה טוב יותר מכתם הפפ-מארט® וגפני. לכן הם ראו את כתם הג'ימסה כאידיאלי לאבחון לישמניאזיס עורי.

התוצאות המצוינות שהושגו על ידי המחברים נובעות מהעובדה ששילוב הצבעים המרכיב את תערובת הג'ימסה מציג את התנאים הדרושים ליצירת ניגודיות חיובית, ומאפשרים להבחין בבירור במבנים של אמסטיגוטות, הן תוך-תאיות והן מחוץ לתא.

הטכניקות האחרות (פאפ-מארט® וגפני) עשו זאת גם כן, אך בצורה חלשה יותר ולכן קשה יותר לדמיין אותה. לכן כתם Giemsa מומלץ לאבחון טפילי של לישמניאזיס.

באופן דומה, מחקר שנערך על ידי Ramírez et al (1994) העריך את תקפותם של כתמי Giemsa ו- Lendrum במריחי הלחמית לזיהוי טרכומטי של כלמידיה.

הכותבים קבעו כי כתמי Giemsa ו- Ledrum הם בעלי ספציפיות שווה, אך Giemsa היה רגיש יותר.

זה מסביר מדוע כתם Giemsa הוא כיום הנפוץ ביותר לאבחון זיהומים כלמידיאליים, במיוחד אם ישנם מעט מקורות.

מקור: מגיבים ל- PanReac Applichem ITW. כתם בג'ימסה. גרסה 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. קסטלר דל ואלס, ספרד.

המלצות להכתמה טובה

אין להאיץ את ייבוש הסדינים. יש לצפות לזמן סביר לייבושו באוויר הפתוח. כשעתיים בערך.

צבע מיד לאחר שעתיים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

כדי שהמריחות יתקנו ויטביעו טוב יותר, יש לחלק את הדגימה בשקופית באופן שיישאר שכבה דקה ואחידה.

דגימת הדם המועדפת היא נימי הדם, מכיוון שהמריחה מיוצרת ישירות מצניחת הדם ולכן הדגימה אינה מכילה תוספים כלשהם, המעדיפים את התחזוקה של מבנים תאיים.

עם זאת, אם משתמשים בדם ורידי, יש להשתמש ב- EDTA כנוגד קרישה ולא כהרין, מכיוון שהפרין בדרך כלל מעוותת תאים.

טעויות נפוצות בכתמים בג'ימסה

בתרגול של טעויות צביעה זו ניתן לבצע. הם מעידים על ידי שינויים פתאומיים בטונליות של המבנים.

צביעה כחולה במיוחד

יכול להיות שזה נובע מ:

מריחות מאוד עבות
חריגה מזמן הכתמה
לשטוף לא מספיק.
שימוש בחומרים ריאגנטים הרבה מעל pH ניטרלי (אלקליין).

בתנאים אלה צבעי המבנים הבאים מעוותים, באופן שהארתרוציטים במקום להכתים ורוד סלמון ייראו ירוקים, גרגירי האאוזינופילים שחייבים להיות מוכתמים בצבע אדום לבנים יהפכו כחלחלים או אפורים וכן הלאה. סטייה בטונים הרגילים.

צביעה ורודה במיוחד