חלבון ה- K הוא אנזים השייך לקבוצת הפרוטאזים הסריניים, כלומר יש לו באמצע חומצה אמינית פעילה בקטלינה, ותפקידו לשבור את קשרי הפפטיד על ידי הידרוליזה. בתורו, אנזים זה שייך למשפחת חלבוני הסאב-תיליסין (פפטידאז S8).
לחלבון חלבון K משקל מולקולרי (MW) של 28,900 דלטון, ובודד לראשונה בשנת 1974 בתמציות של אלבום הפטרייה Engyodontium, שכונה בעבר בשם אלבום Tritirachium Limber.
מבנה מולקולרי של חלבון ק. מקור: Lykchiniadis
יש לו יכולת חלבון גבוהה, שמודגם על ידי יכולתו להשפיל את הקרטין הקיים בשיער. המילה keratin באנגלית נקראת "keratin", ומכאן נקראה "proteinase K".
בשל כוחו הגבוה לקטר את החלבונים הילידים, אנזים זה שימושי בטכניקות ביולוגיה מולקולריות שונות. הוא משמש בעיקר לבידוד והכנת חומצות גרעין במשקל מולקולרי גבוה (MW).
חלבון K פועל על ידי שחרור DNA גרעיני, תוך השמדת חלבונים והפעלת RNases ו- DNases, כלומר, זה מבטל גרעינים בתכשירי DNA ו- RNA.
מצד שני, נראה כי פרוטאינאז K יכול לבצע הידרוליזה של כמה חלבונים טבעיים טבעיים המופלים, מה שעורר את העניין של החוקרים לשימושו במחקר חלבוני פריון (PrPC).
עם זאת, למרות עוצמתם הפרוטאוליטית הגבוהה, ישנם חלבונים העמידים לפעולה של הפרוטאינז K. ביניהם ישנם כמה חלבונים לא תקינים הנקראים prions (PrPSc), הקשורים לאנצפלופתיות ספוגיות הניתנות להעברה.
מאפייני חלבון K
לפרוטאינזה K מבנה שלישוני המורכב משלוש שכבות, כאשר גיליון β בעל שבע שרשראות מוצב בין שתי שכבות של מסוקים. מכיוון שהיא שייכת למשפחת הפפטידאז S8, היא מאופיינת בכך שיש טריאד קטליטי באתר הפעיל שלה, שהסדר העוקב שלו הוא (Asp, His ו- Ser), המבדיל אותו ממשפחות פפטידאז אחרות.
אנזים זה מקבוצת הפרוטאזים הסריניים מאופיין בהידרוגציה של קשרי הפפטיד הקרובים לקבוצה הקרבוקסילית של חומצות אמינו אליפטיות וארומטיות.
מצד שני, הוא מסוגל לפעול בנוכחות חומרים מאכלים מסוימים, כמו נתרן דודציל סולפט (SDS), טריס-HCL ו- EDTA, המשמשים לסייע לדניטציה של חלבונים, וגורמים להם לאבד את המבנה הטבעי שלהם.
זהו שלב מקדים בהכנת חלבונים לטכניקת האלקטרופורזה. טווח החומציות בו פועלת חלבוניאז K הוא רחב למדי (2.0 עד 12.0), עם pH אופטימלי בין 7.5 ל 12.0, והנקודה האיזואלקטרית שלו היא 8.9. כפי שניתן לראות, הוא פעיל כנגד טווח pH רחב מאוד.
מאפיין נוסף הבולט בפרוטאינאז K הוא יציבותו בנוכחות טמפרטורות גבוהות (50 - 60 מעלות צלזיוס).
פעילות אנזימטית
חלבון K דורש נוכחות של יון הסידן, אם כי זה לא משפיע על פעילותו, אם הוא חיוני לשמירה על יציבותו.
על מנת חלבון K לעיכול מלא של המצע, יש צורך במגע של כ -5 דקות עד שעתיים.
עם זאת, במובן זה, Daza et al. השוו את טוהר ה- DNA שהתקבל בזמנים שונים של חשיפה כנגד חלבון K, והסיקו כי דגירה ממושכת (עד 24 שעות) משפרת משמעותית את איכות ה- DNA.
עם זאת, ביחס לריכוז האנזים חלבוניאז K המשמש בפרוטוקולים השונים, ניתן לומר שהוא מגוון מאוד.
ניתן להשתמש בו מריכוזים נמוכים מאוד (5 מיקרוגרם / מ"ל) לריכוזים של 500 מיקרוגרם / מ"ל. אולם ריכוזי העבודה הנפוצים ביותר נעים בין 50-100 מיקרוגרם / מ"ל, במיוחד לעיכול חלבונים והפעלת גרעינים. אם כי לטיפול ברקמות נדרש ריכוז של 2 מ"ג / מ"ל.
יישומים
יישומיה רחבים מאוד וניתן לסכם אותם כדלקמן:
הוא משמש לעיכול חלבונים ומיצוי DNA בשיטות שונות כגון: מליחה, PK-SDS, ציטיל-טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), אשלגן אצטט שונה ומיצוי נתרן יודיד.
הפעלה של גרעינים (RNases ו- DNases).
בטכניקת ההכלאה במקום (HIS), בכדי לסייע בשחרור חומצה גרעינית, בנוסף לחיסול חלבונים לא רצויים.
- שינוי חלבונים.
ברמת המחקר, במחקרים שונים.
יתרונות הפרוטאינאז K
מספר מחקרים השוואתיים בוצעו בין טכניקות מיצוי DNA שמשתמשות בפרוטאינזה K, עם אחרות שאינן משתמשות בה וכל מסקנות שיש יתרונות גדולים יותר בעת השימוש באנזים. היתרונות כוללים את הדברים הבאים:
מתקבל DNA בעל משקל מולקולרי גבוה, באיכות גבוהה וטהרה.
ה- DNA המופק יציב עד 3 חודשים.
ניתן להשתמש ב- DNA המופק בטכניקות הבאות: כתם דרומי, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), אלקטרופורזה, בין היתר.
חלבונים עמידים לחלבון K
מחקירות שונות הגיעו למסקנה כי פריונים (חלבוני PrPSc רעילים לא תקינים) שונים מחלבוני PrPC (ילידים) בכך שהם עמידים לפעולה של חלבוניאז K, ואילו PrPCs רגישים לפעולתו.
מחברים אחרים תיארו כי במבנה ה- PrPSc ישנם חלקים רגישים ואחרים עמידים לפרוטאינזיס K. עם זאת, שני החלקים רעילים ומידבקים באותה מידה.
לעומת זאת, באסטיאן ואח 'בשנת 1987 בודדו 4 חלבונים של 28, 30, 66 ו 76 קדה ממין של Spiroplasma mirum. נמצא כי כולם עמידים לפעולה של פרוטאינאז K וגם היו בעלי תגובה צולבת עם כמה פריונים.
ידוע כי מין זה יכול לגרום לקטרקט ולנזקים נוירולוגיים חשובים ובשל הממצאים המדעיים של בסטיאן, בין שאר החקירות, נעשה ניסיון לקשר בין מיקרואורגניזם זה לבין אנצפלופתיות ספוגיות הניתנות להעברה.
עם זאת, האטיולוגיה של הפתולוגיה הנוירולוגית הניוונית הזו ממשיכה לייחס כיום לפריונים.
במובן זה, באטלר ואח 'בשנת 1991 זיהו ואפיינו סוג של חלבון העמיד לפרוטאינאז K של 40 kda משני זנים של Mycoplasma hyorhinis. פתוגן זה משפיע על חזירים, המדביק את רקמותיהם, אך במקרה זה לא הייתה תגובה צולבת עם ה פריונים שנבדקו.
נדרש מחקר נוסף בכדי להבהיר אלמונים רבים בעניין זה.
הפניות
- Bastian F, Jennings R, ו- Gardner W. 1987. אנטי-סרום לחלבוני פיבריל הקשורים לרסק-סקאבי מגיב עם Spiroplasma miru m fibril חלבונים. ג'יי קלין. מיקרוביול. 25: 2430-2431.
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. הערכת שיטת מיצוי וטיהור DNA מרקמת שריר קבועה עם פורמלדהיד של צופרים לא מזוהים. מגזין מד, 2014; 22 (1): 42-49,
- באטלר G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E ו- Mcgarrity G. זיהוי ואפיון של חלבונים עמידים בחלבון K בקרב חברי הכיתה. זיהום וחסינות, 1991, 59 (3): 1037-1042
- López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. השוואה בין שני פרוטוקולי מיצוי DNA מסוג Trypanosoma cruzi שגדלו במדיום אקסני. הכומר פרו. Med. Exp. בריאות ציבורית; 2014; 31 (2): 222-227. ניתן להשיג ב: scielo.org
- Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ו- Palma W. קביעת האפקטיביות של חמישה פרוטוקולי מיצוי DNA מחומר paraffinized למחקרים מולקולריים. הכמרית מודה יוניב קוסטה ריקה. 2007; 1 (1): 10-19.